【摘 要】
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L-苯丙氨酸是8种必需氨基酸之一,在医药、食品、化工等领域应用广泛,其需求量逐年上升,因此利用代谢工程手段与发酵工程手段挖掘菌株的生产潜力,得到高产、高效的苯丙氨酸生产菌及其配套的生产工艺具有重要的现实意义。本文利用代谢工程手段对一株野生型E.coli W3110进行改造,并对改造后的菌株进行发酵工艺优化,主要研究内容如下:在大肠杆菌中系统优化了苯丙氨酸的合成途径,包括:解除DAHP合酶、预苯酸脱
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L-苯丙氨酸是8种必需氨基酸之一,在医药、食品、化工等领域应用广泛,其需求量逐年上升,因此利用代谢工程手段与发酵工程手段挖掘菌株的生产潜力,得到高产、高效的苯丙氨酸生产菌及其配套的生产工艺具有重要的现实意义。本文利用代谢工程手段对一株野生型E.coli W3110进行改造,并对改造后的菌株进行发酵工艺优化,主要研究内容如下:在大肠杆菌中系统优化了苯丙氨酸的合成途径,包括:解除DAHP合酶、预苯酸脱水酶（PDT）、分支酸变位酶（CM）、莽草酸途径的反馈抑制;强化关键酶活;提高前体物在磷酸烯醇式丙酮酸与4-磷酸赤藓糖供应量;改造PTS系统;加强苯丙氨酸输出能力。最终得到了菌株F13,摇瓶发酵36 h后,产量为24.8 g/L,转化率达到18.7%。针对分子改造造成的生物量下降的问题,研究了维生素H对苯丙氨酸发酵的影响,结果显示适量添加0.5 mg/L的维生素H使得苯丙氨酸的产量达到了70.6 g/L,较不添加对照组提高了9.6%,最大生物量(OD600 nm)为140.5,较对照组提高了11.4%,糖酸转化率为24.7,较对照组下降了2.3%,说明适量添加维生素H具有两面性。通过单因素实验、正交实验、发酵罐验证实验,以关键酶活、产量、转化率、副产物含量等为指标,最终确定了适合L-苯丙氨酸发酵的9种微量元素为及用量。最终优化后生物量为122.8,L-苯丙氨酸产量为85.4 g/L,糖酸转化率为26.3%,分别较不添加微量元素的对照组提高了17.5%、51.4%、18.6%,同时减少了副产物的种类和生成量,提高了关键酶活力。为了提高菌体对氧的利用效率,研究了不同载氧剂对苯丙氨酸发酵生产的影响,结果显示:15%添加量的正十二烷使得比耗氧速率提高了37.0%,摄氧率提高了38.1%,苯丙氨酸产量提高了1.6%,空气氧临界浓度降低了33%,发酵周期缩短了4 h,可回收率为95.5%,循环次数为5次。载氧剂使得对设备的搅拌转速、通风量、罐压的要求减弱,降低了发酵控制难度,同时缩短了发酵周期,节约了发酵成本。优化了补料方式,提出了营养适量流加工艺,苯丙氨酸产量达到了90.7 g/L,糖酸转化率达到了26.7%,同时减少了副产物的积累,通过代谢流分析该策略使得葡萄糖更多的流向了苯丙氨酸的合成途经。使用表面活性剂解决了苯丙氨酸结晶前夕产酸停滞的问题,最终的产量为88.7g/L,较不使用表面活性剂的对照组提升了8.9%,且添加表面活性剂不会对生物量造成影响,同样不会导致副产物的积累,是一种安全、高效的方法。通过代谢工程手段与发酵工程手段相结合,在不同的方面对菌株自身及其生长环境做出合理的优化,最终实现了苯丙氨酸的高效积累。
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