【摘 要】
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L-高丝氨酸是一种非必需氨基酸,是合成苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的重要前体物。L-高丝氨酸虽然不参与蛋白质的合成却是一种重要的功能性氨基酸。作为一种医药中间体,L-高丝氨酸及其衍生物在食品、医药、农业等领域拥有着广泛的市场应用前景。针对于目前关于L-高丝氨酸的合成研究中化学合成法成本高、生物合成法生产效率低的问题,本研究开展了L-高丝氨酸生产菌株的构建研究,具体研究内容和结果如下:（1）弱化降解途
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L-高丝氨酸是一种非必需氨基酸,是合成苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的重要前体物。L-高丝氨酸虽然不参与蛋白质的合成却是一种重要的功能性氨基酸。作为一种医药中间体,L-高丝氨酸及其衍生物在食品、医药、农业等领域拥有着广泛的市场应用前景。针对于目前关于L-高丝氨酸的合成研究中化学合成法成本高、生物合成法生产效率低的问题,本研究开展了L-高丝氨酸生产菌株的构建研究,具体研究内容和结果如下:（1）弱化降解途径,实现L-高丝氨酸的初步积累。在大肠杆菌中先过表达一个解除反馈抑制的L-高丝氨酸合成途径关键酶编码基因thr AC1034T,再以弱启动子P1,P2,P3替换thr ABC操纵子本身的启动子,弱化L-高丝氨酸的降解途径,菌株在基本培养基上正常生长,摇瓶发酵显示菌株H-3的高丝氨酸积累量为1.5 g/L。（2）为强化L-高丝氨酸的合成途径,过表达L-高丝氨酸合成途径关键酶编码基因thr AC1034T。发酵结果显示,双拷贝H-5的高丝氨酸积累量达到了2.6 g/L,产量提升了73.3%,而三拷贝菌株H-6产量却只提升了30.7%。（3）为增加高丝氨酸合成的前体物草酰乙酸的供应,过表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的ppc,发酵结果显示菌株H-7高丝氨酸积累量达到了5.8 g/L。（4）为平衡L-高丝氨酸合成途径中辅酶的供应,引入一个来源于枯草芽孢杆菌依赖于NADH的外源谷氨酸脱氢酶编码基因roc G,利用辅助因子自给系统实现NAD+和谷氨酸的再生,为天冬氨酸合成途径提供充足的谷氨酸和NADPH供应,菌株H-8摇瓶发酵L-高丝氨酸产量达到了7.1 g/L。（5）为继续增加辅因子NADPH的供应,分别采用强启动子Ptrc和自身Ppnt AB启动子增加一个pnt AB的拷贝,来促进NADH向NADPH的转化,提升菌株细胞内还原力供应。以自身启动子来过表达pnt AB的菌株H-9产量达到了8.8 g/L,但是菌株生物量略微降低。（6）为促进胞内高丝氨酸的外排,分别以高拷贝诱导型质粒p Trc99a(Ptrc)、高拷贝组成型质粒p UC19(Plac)、低拷贝组成型质粒p STV28(Plac)来过表达具有高丝氨酸外排功能的转运蛋白编码基因rht A。携带p STV28-rht A质粒的菌株H-13摇瓶发酵高丝氨酸积累量达到了12.5 g/L,生物量恢复正常水平。（7）为考察菌株发酵性能,利用5 L发酵罐对重组菌株H-13进行分批补料发酵实验。菌株经发酵罐培养48 h后,L-高丝氨酸产量为52.1 g/L,糖酸转化率为0.43 g L-高丝氨酸/g葡萄糖。本研究构建了一株稳定高产,非诱导、非缺陷型的大肠杆菌L-高丝氨酸生产菌株,研究结果可为生物法合成L-高丝氨酸的研究提供借鉴和参考。
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