L-缬氨酸属于支链氨基酸,具有改善动物的免疫状态及加快肌肉组织修复的作用,广泛应用于医药、食品和饲料等行业。目前工业上主要通过微生物发酵法生产L-缬氨酸,随着L-缬氨酸市场需求的不断增加,持续优化生产菌株的发酵性能、开发更为经济高效的发酵工艺以提高L-缬氨酸的生产效率也日益引起研究者的关注。本研究以一株大肠杆菌L-缬氨酸生产菌VHY18为出发菌,结合以往研究在构建L-缬氨酸生产菌株时的不足之处,通过代谢工程及发酵工艺优化手段,从多角度对菌株代谢流进行优化,主要策略及结果如下:（1）强化L-缬氨酸合成途径。本研究首先探索Ptrc和Pldh A启动子过表达L-缬氨酸合成途径关键酶基因对L-缬氨酸合成及副产物浓度的影响。经过5 L发酵罐验证,Pldh A过表达L-缬氨酸合成途径关键酶基因的菌株VHY20-2在好氧-厌氧双阶段总的L-缬氨酸为84.4 g/L,较出发菌提高了3.8%,副产物琥珀酸浓度为19.8 g/L,较出发菌降低了22.6%,相应地VHY20-2的糖酸转化率也有所提高,为0.40 g/g葡萄糖。该结果证明引入厌氧启动子可以提高厌氧阶段菌株L-缬氨酸合成途径强度,缓解碳源的溢流,进而提高L-缬氨酸的产量。（2）阻断副产物合成途径。为了进一步降低副产物浓度,本实验探究敲除L-丙氨酸合成（avt A）及转运基因（yga W）、琥珀酸合成相关基因（mae AB、mdh）的效果。摇瓶发酵结果显示,敲除mdh基因的菌株VHY22-3不积累琥珀酸,同时该菌株厌氧阶段L-缬氨酸有明显增加,较对照菌提高了6%。经过5 L发酵罐验证,该菌株在好氧-厌氧双阶段总的L-缬氨酸为81.5 g/L,同时琥珀酸降低至10.5 g/L,较对照降低了44.7%。其次L-丙氨酸也有所降低,为1.2 g/L,达到较低的水平,相应地VHY22-3的糖酸转化率也有所提高,为0.41 g/g葡萄糖。该结果证明敲除mdh基因能够有效的降低副产物的积累,提高L-缬氨酸的生产效率。（3）优化限氧发酵阶段的供氧条件、好氧发酵阶段向限氧发酵阶段的转换时机及葡萄糖的流加速率。本研究在菌株改造的基础上对好氧-厌氧双阶段发酵工艺进行了系统的优化。首先设置不同梯度的供氧条件来探究其对菌株副产物琥珀酸积累及菌株活力的影响,5 L发酵罐发酵数据显示,A3（转速400 r/min,通风量2 L/min）供氧条件最优,其L-缬氨酸积累量为85.1 g/L,较对照提高了4.8%,琥珀酸为1.8 g/L,较对照降低了84.3%,糖酸转化率为0.46 g/g葡萄糖,较对照提高了12.2%。该结果证明供氧条件的提高可显著降低琥珀酸浓度,提高菌株的产酸效率。接着设置不同供氧条件转换时机来进一步探究其对菌株产副产物琥珀酸的影响,5 L发酵罐发酵数据显示,B2(好氧发酵至14 h,OD600值大约为35时转换供氧条件)条件最优,其L-缬氨酸积累量为86.1 g/L,琥珀酸降低至1.5 g/L,糖酸转化率为0.48 g/g葡萄糖,较对照提高了4.3%。该结果表明转换时机不断的提前,琥珀酸浓度有降低的趋势,相应地菌株糖酸转化率有一定提高。最后设置不同葡萄糖流加速率来探究其对菌株产L-缬氨酸及副产物琥珀酸的影响,5 L发酵罐发酵数据显示,随着葡萄糖流加速率增加,L-缬氨酸的积累量增加,同时副产物琥珀酸也随之增加,相应地菌株的糖酸转化率有降低趋势。综合来说C2（25 g/h）条件最优,其L-缬氨酸积累量为90.4 g/L,琥珀酸为1.2 g/L,糖酸转化率为0.53 g/g葡萄糖。该菌株和发酵过程优化结果证明改造后菌株及工艺具有良好的工业价值。经过上述代谢工程及发酵工艺优化,使新菌株在优化后的工艺下有较高的L-缬氨酸产率,且副产物较低。