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目的:课题组前期通过生物信息学分析提示NGO2105蛋白可能是淋球菌中一种新的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白,本课题拟对NGO2105蛋白是否具有丝氨酸蛋白酶自转运蛋白特征及其在致病过程中的作用进行研究,为深入了解淋球菌的致病机理和探寻新的蛋白疫苗靶点提供实验依据。方法:原核表达NGO2105蛋白passenger结构域截短蛋白并制备多克隆抗血清,用于定位分析。通过缺失突变的方法构建淋球菌ngo2105基因缺失突变株,以pCTS32质粒构建ngo2105基因回复菌株。采用流式细胞分析技术、Western blot技术分析NGO2105蛋白的表面定位和分泌特征。利用点突变技术将NGO2105蛋白酶活性催化三联体结构中的267位丝氨酸突变为丙氨酸,以验证其丝氨酸蛋白酶活性是否参与passenger结构域的酶切与分泌过程。进一步将大肠杆菌自转运蛋白Hbp的passenger结构域与NGO2105蛋白的translocator结构域融合,通过分析Hbp的passenger结构域蛋白表面定位,以验证NGO2105蛋白translocator结构域是否具有转运异源蛋白的功能。利用人宫颈癌上皮细胞探究NGO2105蛋白在淋球菌黏附及侵袭过程中的作用,同时研究抗NGO2105抗体和抗passenger抗体对细菌黏附的抑制能力。利用雌激素处理的小鼠淋球菌阴道感染模型,研究NGO2105蛋白在淋球菌定植过程中的作用,同时分析抗NGO2105抗体在抑制淋球菌定植中的作用。结果:成功表达、纯化出NGO2105蛋白passenger结构域截短蛋白,免疫小鼠后可获得效价达到5.12×10~5的多克隆抗血清,可满足后续实验要求。成功构建了ngo2105基因缺失突变菌株和ngo2105基因回复菌株。流式细胞技术及Western blot技术分析结果显示NGO2105蛋白定位于菌体表面,并通过自体水解切割,分泌至外环境。成功构建了NGO2105 S267点突变菌株,Western blot分析显示S267A点突变后NGO2105蛋白passenger结构域不能被水解切割分泌至培养基,流式细胞分析显示点突变后NGO2105蛋白仍可定位于细菌表面,提示NGO2105蛋白的丝氨酸蛋白酶活性介导passenger结构域的自体切割及分泌过程。成功构建Hbp蛋白passenger结构域与NGO2105蛋白translocator结构域的融合蛋白,通过流式细胞技术及免疫荧光显微镜观察分析显示Hbp蛋白passenger结构域定位于细菌表面,提示NGO2105蛋白translocator结构域具有转运异源蛋白的功能。细胞黏附侵袭实验结果显示淋球菌ngo2105基因缺失突变株的黏附、侵袭能力相对于野生株显著下降,抗NGO2105抗体和抗passenger抗体能够抑制淋球菌的黏附作用。小鼠阴道定植实验结果显示淋球菌ngo2105基因缺失突变株在体内的定植能力较野生株显著下降,抗NGO2105抗体能够抑制淋球菌阴道内的定植能力。结论:本研究证实NGO2105蛋白符合自转运蛋白分泌特征,是淋球菌中一种新的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白。该蛋白在淋球菌的黏附、侵袭及小鼠阴道内定植过程中发挥着重要作用,是淋球菌致病过程中一种重要的毒力因子。抗NGO2105抗体能有效抑制淋球菌的黏附能力及在小鼠体内的定植能力,提示NGO2105蛋白可能是一种潜在的蛋白疫苗靶点。