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枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)广泛应用在食品、农业、饲料、环保等领域。贵州地区细菌型豆豉的独具特色风味,深受人们的喜爱。但枯草芽孢杆菌产豉香的产香机制研究鲜有报道。研究利用专利菌株B.subtilis BJ3-2进行中温(45℃)和中低温(37℃)转录组测序结果,生物信息学分析筛选获得16个显著差异基因,结合文献报道及基因的代谢通路分析,最终获得3个基因作为豉香风味候选基因进行研究,取得的结果如下:1.通过前期对B.subtilis BJ3-2 45℃和37℃的第二代转录组测序结果分析,包括基因表达量、差异基因KEGG、GO注释和富集分析,控制筛选条件:基因是否存在意义、基因功能描述(除去保守假定蛋白)、Log2FC(BJ 3-2 45℃/BJ3-2 37℃)≧2.5,筛选出16个显著差异基因,结合文献及代谢通路分析,选取3个显著差异基因cysC(腺苷酰硫酸激酶)、uxuA(D-甘露醇脱水酶)、rapF(反应调节剂天冬氨酸磷酸酶f)为豉香候选基因。2.对cysC、uxuA、rapF表达量进行荧光定量PCR验证。采用16S rRNA作为内参基因,结果显示cysC基因表达量下调0.22倍、uxuA和rapF的基因表达分别上调了41.35倍、2.21倍。其结果与转录组测序结果趋势一致。3.成功构建cysC、uxuA和rapF的同源重组双交换敲除载体。以pUC18为原始载体,分别设计靶基因5’和3’端限制性酶切位点(Sac I、Bam H I、Pst I、Eco R I、Xba I),BJ3-2基因组扩增分别获得的各候选基因同源左臂(HLarm)和右臂(HRarm)以及pHT01 cas9-p43载体上的氯霉素乙酰转移酶基因(cat)进行酶切、连接。经过菌落PCR、质粒PCR、双酶切和测序验证,最终构建cysC、uxuA和rapF的重组敲除载体pUC18+HLarm+cat+HRarm。利用化学法分别转化至B.subtilis BJ3-2中,通过菌落PCR筛选、质粒PCR和测序验证,革兰氏染色最终成功筛选获得BJ3-2△cysC基因的敲除菌株。4.感官评价表明,BJ3-2△cysC发酵的豆豉比BJ3-2发酵的豆豉豉香更浓郁,颜色较暗、皮少许褶皱、菌丝较少,不拔丝。GC-MS显示,挥发性物质包括:吡嗪类、酸类、醌类、酯类、酮类、醇类等。分析由于cysC存在于硫代谢与嘌呤代谢中,敲除该基因后,会导致硫酸盐无法生成半胱氨酸,使丙酮酸代谢受到影响,从而影响豉香的风味。进一步分析显示,三甲基吡嗪(trimethyl pyrazine)、2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethyl-pyrazine)、四甲基吡嗪(tetramethyl pyrazine)分别增加了12.774%、8.901%、4.362%。三甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪分别为豉香贡献了榛子香气、可可香气或巧克力香气,烤花生香气。2,3-丁二醇、1,3-丁二醇、乙偶姻降低了11.489%、5.760%、3.758%,酸类物质包括2-乙基丁酸、乙酸、戊酸和异丁酸分别降低3.4%、2.715%、1.255%、0.817%。2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪的微生物体内合成与L-苏氨酸有关。丙酮酸的变化与2,3-丁二醇、乙偶姻、乙酸的变化直接相关。分析这些物质是通过丙酮酸代谢、氨基酸代谢等多条代谢途径最终影响TCA循环,最终影响豉香的风味。5.苯甲醛、3-辛醇,在枯草芽孢杆菌BJ3-2发酵豆豉中未被检测到,在枯草芽孢杆菌BJ3-2△cysC发酵豆豉中被检测到。推测苯甲醛具有的苦杏仁味和强烈的樱桃香气和3-辛醇具有油脂、果仁和草药香味特殊性气味,对豉香风味有重要贡献作用。综上所述,cysC是豉香风味的功能基因,其编码的酶负调控豉香风味,吡嗪类、酸类物质是豉香的重要风味物质。硫代谢、氨基酸代谢、丙酮酸代谢能影响豉香风味的形成。