研究背景和目的据统计全球肿瘤新发病例中，结直肠癌新发病例超过120万，死亡病例约60.87万，在男性肿瘤新发病例中居第3位，女性肿瘤新发病例中居第2位，其中有60%~70%的患者死亡时存在结肠癌的肝转移。对于结肠癌的治疗，除了少数可行手术根治术外，绝大部分结肠癌患者因不具备手术条件，治疗手段以化疗为主。然而化疗的毒副作用及其所引起的多种并发症仍是肿瘤治疗方面的一大难题，所以医生们将目光投向生物治疗。靶向治疗作为肿瘤生物治疗手段之一，为降低化疗药物的毒副作用增加其疗效带来了福音，可以作为化疗的补充。虽然目前已有西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向治疗药物为NCCN（National comprehensive cancer Network，美国国立综合癌症网络）治疗指南所推荐，但新的靶向药物的研发、化疗药物联合生物治疗及其他生物疗法的研究仍在不断进行中。病毒抗肿瘤治疗为肿瘤生物疗法之一，目前已经过临床评估的抗肿瘤病毒主要包括腺病毒、单纯疱疹病毒、呼肠病毒、牛痘病毒以及新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）。作为鸟类副粘病毒科下副黏病毒属的新城疫病毒，自被发现其具有抗癌潜能以来，关于NDV抗肿瘤的研究已成为经久不衰的课题。NDV对肿瘤细胞的特异性杀伤作用已经得到了基础实验和临床应用上的证实。NDV的各种抗肿瘤机制随着众多研究成果的产生也逐渐明朗和系统化。已有临床应用证实NDV修饰的自体瘤对大肠癌肝转移病人的治疗有良好的效果。在美国，NDV被NC（INational cancer institute，美国国家癌症研究所）列为候选抗肿瘤药物。我们课题组自2004年以来，利用分离得到的NDV弱毒株NDV7793进行抗瘤的基础研究，证实NDV7793不但在体外对人结肠癌细胞有杀伤作用，而且能抑制裸鼠结肠癌的生长。5-Fu作为结肠癌中重要的基础化疗药物之一，应用于大肠癌的临床治疗已近50年。但是近年来越来越多的患者对5-Fu产生了耐药，使得5-Fu的疗效大为降低。因此为提高5-Fu的疗效并降低5-Fu的毒副作用，5-Fu联合联合生物治疗的研究得到不断的开展。本课题旨在研究NDV7793对小鼠结肠癌肝转移的抑制作用，同时探讨NDV7793与5-Fu联合治疗的效果，以及NDV7793对结肠癌肝转移模型小鼠免疫功能的影响，为NDV7793应用于临床实践提供实验依据。研究内容和方法1.小鼠结肠癌肝转移模型的建立常规培养小鼠结肠癌CT26细胞。通过脾脏注射脾脏保留法，将约1×106个小鼠结肠癌细胞CT26注射至小鼠脾脏包膜下建立小鼠结肠癌肝脏转移模型。待小鼠自然死亡后，观察小鼠腹腔内成瘤情况，取肝脏作HE染色。2. NDV7793对小鼠结肠癌肝转移的抑制采用鸡胚种植法培养扩增NDV7793病毒，并用超速离心法将之纯化，备用。分组给药：将结肠癌肝转移小鼠模型随机分为PBS阴性对照组，5-Fu阳性对照组，NDV7793给药组，NDV7793联合5-Fu给药组。每组20只小鼠，腹腔注射给药，0.1mL/只，从建模当天开始连续给药10天。每组随机选取10只小鼠，用重复测量法分析各组药物对小鼠体重的影响，并对各组小鼠进行生存分析。剩余小鼠于给药结束后第6天处死，取各组小鼠完整肝脏，先称量小鼠肝脏重量比较各组抑瘤率；然后大体观察比较各组肝脏表面结肠癌转移情况，再作常规包埋、切片、HE染色进行光镜下病理学分析，并进行癌灶计数。3. NDV7793对结肠癌肝转移模型小鼠免疫功能的影响小鼠结肠肝转移模型的建立及实验分组、给药，同上所述。于停药后第6天处死各实验组小鼠，并称量各组小鼠胸腺及体重以计算胸腺指数；细胞因子的检测：称取各实验组处死后小鼠的肝脏，采用手工玻璃匀浆法对肝脏匀浆，获取上清液，用ELISA方法分别检测各组小鼠肝脏匀浆上清液中的IL-2、IFNγ、TNFα、IL-17表达水平。正常对照组为随机法获取的同龄10只健康小鼠，每日给每只小鼠腹腔注射PBS缓冲液0.1ml，连续注射10日，也于停药后第6天处死。研究结果1.成功构建小鼠结肠癌肝转移模型，建模成功率为90%（27/30）。2.对小鼠结肠癌肝转移的抑制效果1）与PBS阴性对照组相比，NDV7793给药组可减缓小鼠体重的增长速率；5-Fu阳性对照组在5-Fu给药期间小鼠体重增长受抑制，甚至使小鼠体重快速减轻；联合给药组在NDV7793给药期间减缓小鼠体重的增长速率、在5-Fu给药期间小鼠体重下降。2）对各组进行生存分析可得：NDV7793给药组生存期短于联合给药组（P=0.000＜0.001），但是显著长于5-Fu阳性对照组以及PBS阴性对照组，差异具统计学意义（P=0.000＜0.001）。3）对各组抑瘤率统计分析可得：NDV7793给药组、联合给药组、5-Fu阳性对照组在建模后的16天内都对小鼠结肠癌肝转移有抑制作用，NDV7793给药组的抑瘤率高于5-Fu阳性对照组（P＝0.000＜0.01）；但是NDV7793给药组的抑瘤率与联合给药组相比较，差异无统计学意义（P＝0.871＞0.05）。4）对于肝脏癌灶计数情况的观察：NDV7793给药组的肝脏癌灶数量要少于5-Fu阳性对照组及PBS阴性对照组（P＝0.000＜0.01）；而NDV7793给药组与联合给药组比较，癌灶减少数相差不大（P＝0.733＞0.05）。5）大体标本观察可见：PBS阴性对照组几乎整个肝脏被癌灶所浸润，其表面少见正常组织；5-Fu阳性对照组癌灶范围达90%以上；NDV7793给药组和联合给药组的癌灶范围仅为肝脏的1/2左右。6）病理学检查结果显示：与PBS阴性对照组相比，NDV7793给药组、联合给药组小鼠癌灶中细胞形态模糊，细胞坏死或凋亡范围较大。3.对于小鼠免疫功能的影响1）NDV7793给药组的胸腺指数高于联合给药组（P＝0.004＜0.01）；联合给药组胸腺指数高于PBS阴性对照组和5-Fu阳性对照组（P＝0.000＜0.01）。2）NDV7793给药组小鼠肝脏组织的IL-2表达水平明显高于PBS阴性对照组（P＝0.000＜0.05）以及5-Fu阳性对照组（P＝0.000＜0.05）；NDV7793给药组肝脏IL-2表达水平低于联合给药组（P＝0.000＜0.05）。3）肝脏组织IFNγ检测水平显示：NDV7793给药组IFNγ表达水平高于PBS阴性对照组（P＝0.000＜0.05）和5-Fu阳性对照组（P＝0.005＜0.05），且明显低于联合给药组（P＝0.000＜0.05）。4）TNFα检测结果显示：NDV7793给药组TNFα表达水平高于PBS阴性对照组（P＝0.000<0.05）和5-Fu阳性对照组（P＝0.000＜0.05），且低于联合给药组（P＝0.000<0.05）。5）IL-17检测结果显示：NDV7793给药组IL-17表达水平高于PBS阴性对照组（P＝0.022＜0.05），低于联合给药组（P＝0.000＜0.05），但与5-Fu阳性对照组无显著性差异（P＝0.074＞0.05）。结论1.本实验成功构建结肠癌肝转移小鼠模型。2. NDV7793对小鼠结肠癌肝转移的抑制作用比5-Fu的抑瘤效果更佳，与5-Fu联合应用后，虽然生存期有所延长，但抑瘤效果并未得到增强。3. NDV7793可以改善荷瘤小鼠的免疫功能。NDV7793还可上调结肠癌肝转移小鼠肝脏中IL-2、IFNγ、TNFα以及IL-17的水平，且与5-Fu联合应用后效果更佳。