单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes),是一种常见食源性病原菌,是李斯特菌属中致病力最强的革兰氏阳性无芽孢杆菌,可引发多种疾病,致死率高(20%～30%),在熟食、水产产品、冷冻食品及食用菌中均有检出,因此快速检测和诊断单增李斯特菌对食品安全意义重大。但食源性致病菌的传统检测方法耗时长、检测限低,不利于致病菌的快速检测。近年来针对转基因作物和病毒开发出基于核酸标准物质检测技术,能够使核酸扩增检测方法标准化,提高实验室间检测结果一致性和准确性。而我国在核酸标准物质的研制方面刚刚起步,数量和种类远远不能满足当前市场及监督检验的需求,对于单增李斯特菌毒力基因检测相关质粒定性标准物质的研制更是少之又少。本文通过提取单增李斯特菌标准菌株全基因组DNA,以此作为模板对毒力基因引物hly A、prfA1、prfA2进行PCR扩增,回收这3种毒力基因扩增的目的片段;分别克隆至载体p LB-simple Vector中,构建分别含有对应毒力基因的重组质粒;通过菌落PCR和测序对重组质粒进行检验,将转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存,大量提取质粒进行冻干,制成冻干粉,即初步得到用于检测单增李斯特菌的质粒标准品。根据菌落PCR和测序验证结果显示,本研究成功构建出含有hly A、prfA1、prfA2毒力基因的质粒标准物质,浓度、纯度和稳定性均达到要求。且在长期稳定性实验检测中,质粒标准物质的稳定性良好。同时发现PCR的敏感性受靶基因的影响,不同毒力基因的检测限也不同。将构建含有hly A、prf A1、prfA2毒力基因的质粒标准品作为阳性对照用于对30批次银耳样品的检测,有1批样品检测出prfA1和prfA2,检出率为3.3%。并对检测结果呈阳性的银耳样品通过传统微生物检测方法验证,但传统检测方法没有获得目标菌株,可能是在环境胁迫或优势菌株的存在下,目标菌株进入休眠或是VBNC状态。此种状态下的菌株在传统检测方法下不易被检出,大大降低了检出率,同时说明了PCR方法的灵敏度高于传统检测方法。