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目的:在雄性生殖内分泌中,睾酮（Testosterone,T）是最重要的一种类固醇激素,在精子发生和维持雄性第二性征中发挥至关重要的作用。在体内,睾酮生成整个过程受下丘脑-垂体-性腺轴的调控,主要在睾丸间质细胞中由各种类固醇生成酶催化生成。多氯联苯（Polychlorinated biphenyls,PCBs）是一种被广泛应用于生活中的难以降解的环境污染物,能通过不同的途径在人体富集,给人类的健康带来威胁,尤其是对生殖系统。已有研究发现,高暴露于多氯联苯能显著降低血清睾酮水平、破坏血睾屏障、降低睾丸相对质量及精子数目和质量,多方面影响雄性生殖能力,而其干扰睾丸间质细胞睾酮分泌的具体分子机制还有待进一步阐明。微管亲和调节激酶4（Microtubule affinity regulating kinases 4,Mark4）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,已被证明在脂肪细胞中能促进脂肪积累、诱导氧化应激和炎症反应,而在类固醇代谢中未见相关报道。我们在前期研究中发现,PCB153可上调睾丸间质细胞Mark4的水平,由此我们提出Mark4可能参与PCB153对睾丸间质细胞功能的影响过程。本研究拟选用多氯联苯单品PCB153作为处理因素,通过体内外实验探究Mark4在PCB153影响睾丸间质细胞睾酮合成过程中发挥的作用。方法:1.筛选没有明显致死效应的PCB153细胞处理剂量。用不同浓度的PCB153处理小鼠睾丸间质细胞TM3细胞系,依次于6、12、24、48 h使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。2.PCB153对小鼠睾丸间质细胞TM3细胞睾酮合成的影响。使用筛选出来的PCB153处理浓度,即5、10、20μg/ml处理TM3后,进行（1）在不同时间点分别检测培养液中睾酮浓度;（2）免疫印迹检测Mark4、类固醇生成相关酶表达,凋亡相关蛋白表达及相关信号通路的激活情况;（3）检测试剂盒PCB153处理后细胞活性氧（ROS）水平、过氧化氢酶（CAT）活性变化;（4）JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位。3.体内实验探究PCB153对睾酮合成和精子发生的影响。选取成年SD大鼠,腹腔注射PCB153染毒后,收集血清、睾丸组织,进行（1）ELISA检测血清睾酮（Testosterone,T）、雌二醇（Estradiol,E2）、促黄体生成素（Luteinizing Hormone,LH）水平;（2）制作石蜡切片,HE染色计数Ⅷ期生精小管数量;（3）透射电镜观察睾丸间质细胞线粒体结构完整性。4.敲低Mark4表达对PCB153抑制TM3细胞睾酮分泌的影响。Mark4 siRNA与PCB153联合处理,检测细胞增殖、睾酮合成、ROS、CAT活性等上述指标的变化。5.NF-κB抑制剂对PCB153诱导TM3细胞氧化应激、降低睾酮合成的影响。筛选刚好能抑制PCB153对NF-κB信号通路激活作用的PDTC细胞处理浓度。使用10μM的PDTC提前处理细胞2 h后,加入20μg/ml PCB153处理24 h,检测上述指标的变化。6.大鼠体内抑制NF-κB活性后PCB153对大鼠睾酮分泌的影响。选用不同浓度的PDTC联合PCB153大鼠腹腔注射,WB检测睾丸组织NF-κB信号通路激活情况,ELISA检测大鼠血清T、LH、E2水平变化。结果:1.PCB153抑制TM3细胞存活和睾酮分泌:CCK-8实验结果显示PCB153处理后,TM3细胞存活受到影响。ELISA检测培养液中睾酮浓度,10、20μg/ml PCB153能显著抑制TM3细胞睾酮分泌;WB结果显示类固醇生成酶StAR和3β-HSD下降,Mark4表达水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平显著下降。2.PCB153激活NF-κB诱导TM3细胞产生氧化应激、影响线粒体功能:WB结果发现PCB153处理后p-p65/p65比值升高,NF-κB信号通路被激活;试剂盒检测发现细胞ROS显著上升,CAT活性下降;JC-1检测结果显示细胞内绿色荧光显著增加,线粒体膜电位下降。3.PCB153降低大鼠体内睾酮生成并影响精子发生:与对照组相比,大鼠PCB153体内处理组血清睾酮水平下降,LH水平上升,睾丸组织HE染色发现Ⅷ期生精小管数量下降,精子发生受到影响;透射电镜结果显示睾丸间质细胞线粒体肿胀,密度降低,线粒体结构受损。4.敲低Mark4表达可部分拮抗PCB153对睾酮生成的抑制作用:Mark4 siRNA转染TM3细胞降低Mark4表达,联合PCB153处理,发现与Ctrl siRNA+PCB153组相比,Mark4 si RNA+PCB153组PCB153不能使StAR水平降低,也不能显著激活NF-κB信号通路,但PCB153处理仍能降低Bcl-2水平;同时,敲低Mark4表达后,PCB153不能诱导细胞氧化应激升高,PCB153引起的CAT活性和线粒体膜电位降低也被缓解,PCB153对睾酮生成的抑制作用被部分拮抗。5.NF-κB信号通路抑制剂可部分缓解PCB153对睾酮合成的抑制作用:使用刚好能抑制PCB153对TM3细胞NF-κB信号通路激活作用的PDTC浓度,即10μM PDTC预处理细胞2 h后,PCB153联合处理24 h,ELISA检测培养上清睾酮发现抑制NF-κB信号通路能在一定程度上缓解PCB153对TM3细胞睾酮合成的抑制作用;ROS检测发现,PDTC+PCB153处理组PCB153仍能诱导氧化应激升高但与PCB153组相比显著缓解;PDTC抑制NF-κB信号通路后,PCB153不能降低CAT活性;JC-1检测线粒体膜电位发现,PDTC+PCB153处理组PCB153仍能降低线粒体膜电位但降低程度低于PCB153处理组。体内实验中,抑制NF-κB信号通路能显著缓解PCB153对大鼠血清睾酮合成的抑制作用。结论:多氯联苯PCB153通过促进Mark4蛋白表达激活NF-κB信号通路,诱导睾丸间质细胞产生氧化应激,造成睾酮合成障碍。