橘小实蝇是一种危险性的果蔬害虫,给农业生产带来了巨大的经济损失。CRISPR/Cas9基因编辑技术的迅猛发展为农业害虫的科学防治带来了新的发展契机。本研究以橘小实蝇生殖发育相关的三个目标基因(boule、rhomboid、sex peptide receptor)为对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究其功能,探讨CRISPR/Cas9在橘小实蝇研究中的可行性,比较这些基因编辑敲除后对橘小实蝇生殖功能的影响,筛选为未来建立橘小实蝇遗传防控,特别是基于CRISPR/Cas9基因编辑的绿色防控技术提供靶基因。研究结果如下:1.克隆获得Bdbol基因,发现其在精巢表达量最高,显著性高于卵巢的表达量。筛选得到了两个高活性sgRNA(B-sg2、B-sg5)用于CRISPR/Cas9基因敲除。在突变品系G0中有64.70%的个体发生了基因突变,其中突变个体的平均嵌合率达到了63.42%。突变体Bdbol~-雄虫回交后代G1的胚胎孵化率出现了显著的降低(Student’s t-test,P<0.05),甚至于完全不孵化。精子活力检测发现Bdbol~-G1代与G2代雄虫的精子活力均出现显著下降,活精子数量明显减少,精子死亡数量显著性增多(Student’s t-test,P<0.05),精子总数没有明显变化。Bdbol~-G1与Bdbol~-G2中活精子的比例分别为55.9%、41.6%。突变体雄虫的生殖系统发育异常,Bdbol~-G1代与G2代的雄虫精巢组织均出现了半透明状以及精巢白化的异常现象,且精巢形态发育异常。2.克隆获得Bdrho基因,发现其在雄虫的表达量显著高于雌虫,精巢相对于其他组织高表达。筛选获得了两个sgRNA(R-sg1、R-sg2)用于CRISPR/Cas9基因敲除。在突变品系G0中有41.67%的个体出现了基因突变,突变个体的平均嵌合率为48.45%。突变体Bdrho~-雄虫回交后代G1的胚胎孵化率出现了显著的下降(Student’s t-test,P<0.05)。Bdrho~-G1以及Bdrho~-G2的精子总数明显的减少,活精子比例显著性的降低(Student’s t-test,P<0.05)。3.克隆获得Bdspr基因,发现其雌虫相对于雄虫高表达,组织的高表达主要集中于神经系统(CNS)分布的部位--头、胸及肠道。筛选得到了两个sgRNA(S-sg1、S-sg5)用于CRISPR/Cas9基因敲除。在突变品系G0中有55.87%的个体出现基因突变,突变个体的平均嵌合率为33.92%。突变体Bdspr~-雌虫回交的单雌产卵总量出现显著的下降。Bdspr~-雌虫的平均产卵量为193.8粒,相较于野生型(504粒/头)呈现极显著差异(Student’s t-test,P<0.001)。突变体Bdspr~-G1代雌虫的卵巢组织中出现了卵粒被黄色包被以及卵色异常的现象,卵巢形态大小异常,但储精囊发育正常。Bdspr~-G2代的胚胎也出现了异常的黄色卵粒。这表明Bdspr基因在调控卵巢发育以及卵粒状态时发挥作用。4.在3个候选基因中,我们发现Bdbol基因的个体突变比例(突变个体数/成活总数)为64.70%,高于(Bdrho基因,41.67%)及(Bdspr基因,55.87%)。Bdbol基因的突变个体平均嵌合率(突变个体中突变细胞数/细胞总数)达到了63.42%,远高于(Bdrho基因,48.45%)和(Bdspr基因,33.92%)。并且,在敲除之后,Bdbol~-突变对后代的影响更加显著。因此,在这三个靶基因中,Bdbol基因与CRISPR/Cas9系统具有最好的适配性。此外,考虑到昆虫不育技术(SIT)在害虫防治方面的成功应用经验,选择靶标于雄性不育的基因具有更好的可操作性。Bdbol~-雄虫后代的平均孵化率为23.17%也比Bdrho~-雄虫的28.33%更低。综上所述,Bdbol基因作为橘小实蝇绿色防控与遗传改造的靶基因具有更高的应用潜力。