论文部分内容阅读
中药远志为远志科植物远志(Polygala tenuifolia Willd.)和卵叶远志(Polygala sibirica L.)的干燥根,具有安神益智的功效,长久以来临床一直将其用于心肾不交引起的失眠多梦、健忘惊悸、神志恍惚等症。远志皂苷是远志益智作用的主要活性成分,但其毒性较强。研究发现,远志皂苷经碱水解使酯键断开后,其毒性显著降低,且具有显著益智作用。远志皂苷水解物主要成分为3,4,5-三甲氧基肉桂酸(3,4,5-Trimethoxy-cinnamylic acid, TMCA)、对甲氧基肉桂酸(p-Hydroxy methyl cinnamate, PMCA)和细叶远志皂苷(Tenuifolin, TF),化学性质稳定。本研究通过液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)和脑微透析取样技术,以整体实验动物研究给予远志皂苷水解物后的血液和脑药代动力学过程,并利用体外Caco-2细胞模型研究了其吸收转运机制。首先,本文建立了大鼠血浆中远志皂苷水解物主要成分TMCA、TF和PMCA的LC-MS/MS测定方法。色谱分离以Thermo BDS Hypersil C18(4.6mm×100mm,2.4μm)为色谱柱,乙腈-水(均含0.2%甲酸,50：50)为流动相,流速0.4mL/min。质谱条件为电喷雾离子源(ESI),检测方式为负离子多反应监测模式(MRM),用于上述三个化合物定量分析的离子对分别为m/z237.0→103.0、m/z679.5→425.3和m/z177.0→116.6；选用甘草酸为内标物,并采用乙酸乙酯液液萃取方法处理生物样品。TMCA和TF标准曲线的线性范围为0.01～5.00μg/mL,最低检测限分别为1ng/mL和0.5ng/mL:PMCA标准曲线的线性范围为0.10～50.00μg/mL,最低检测限为10ng/mL。三个被测物的日内、日间精密度(RSD)均小于14.82%,日内、日间准确度在93.20%～113.31%之间,回收率为96.64%～111.98%,均符合进行药代动力学研究的生物样品分析要求。其次,本文应用已经建立的LC-MS/MS分析方法,研究了远志皂苷水解物经口服和静脉给药后在大鼠体内的药代动力学特性。体内药代动力学结果显示大鼠口服远志皂苷水解物100mg/kg(相当于TMCA24.70mg/kg, PMCA7.70mg/kg, TF14.90mg/kg)后,TMCA和PMCA能在9min内很快达到血药浓度的峰值(6.33μg/mL和4.54μg/mL),可以快速发挥作用,有较高生物利用度,分别为90.12%和98.30%,同时TMCA和PMCA在体内被很快消除,其消除半衰期t1/2,λz分别为0.63h和1.02h。TF在24min达到血药浓度的峰值0.37μg/mL,而且生物利用度很低,仅为2.09%,但其在体内消除较慢约5h。大鼠静脉给予远志皂苷水解物20mg/kg(相当于TMCA4.94mg/kg, PMCA1.54mg/kg,TF2.98mg/kg)后,TMCA和PMCA的血浆药物浓度快速下降,总体清除率CL分别为5.25L/h/kg和2.40L/h/kg,表明TMCA和PMCA在大鼠血浆中被快速清除,体内滞留时间短；而TF的CL为0.22L/h/kg,显示其清除缓慢,能在体内长时间滞留。研究表明,TMCA、PMCA和TF都可能是远志皂苷水解物益智药效的活性成分。再次,本文以体外Caco-2细胞模型,对远志皂苷水解物在人体肠壁吸收机理进行研究。结果显示,TMCA和PMCA易透过单层细胞膜,在远志皂苷水解物浓度为50～150μg/mL范围内,表观渗透系数(PappAP→BL)分别为(10.43～13.88)×10-6cm/s和(13.17～16.76)×10-6cm/s。相比之下,TF透膜能力差,其表观渗透系数(PappAP→BL)仅为(0.72～0.94)×10-6cm/s。在Caco-2细胞模型上,不同浓度的TMCA. PMCA和TF从AP→BL面和BL→AP面的Papp值无统计学差异,且其Papp值不会随药物浓度的增加而改变而转运量却会随浓度的增加而增加。上述结果表明,TMCA、PMCA和TF在小肠上皮细胞上主要以被动扩散的方式进行转运,且无外排转运机制。最后,本文采用脑微透析体内连续采样技术,以清醒大鼠为实验动物,LC-MS/MS法测定静脉给药后透析液中的药物浓度。采用增量法对探针回收率进行考察,结果显示,TMCA、PMCA和TF的探针回收率分别为16.84±0.67%、22.76±0.65%和8.15±0.16%,在所研究的浓度(50～500ng/mL)范围之内,探针的回收率不因浓度的变化而发生改变。大鼠静脉给予远志皂苷水解物20mg/kg(相当于TMCA4.94mg/kg, PMCA1.54mg/kg, TF2.98mg/kg)后,在其脑透析液中只检测到TF,未检测到TMCA和PMCA。脑脊液中TF的浓度在0-42min内呈上升的趋势,在42min左右,达到最高浓度0.25μg/mL,消除半衰期为2.40h,药时曲线下面积(AUC0-∞)为0.53h*μg/mL; TF在大鼠血中的AUCo-∞为10.62h*μg/mL,其血脑屏障穿透力为4.99%。结果表明,TF能透过大鼠血脑屏障到达脑组织而发挥神经生物活性,说明TF很可能是远志皂苷水解物益智作用的有效成分。本论文研究结果揭示了远志皂苷水解物的主要成分TMCA、PMCA和TF的体内药代动力学特性和可能的吸收转运机制,结果发现TF很可能为远志皂苷水解物益智作用的有效成分,为远志皂苷水解物益智药物的研究提供了实验依据,为此类药物的开发利用提供参考。