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目的:通过基因工程技术构建并筛选获得高表达的rhFGF12工程菌株,建立可溶性形式表达rhFGF12蛋白的发酵工艺及纯化技术和蛋白活性测定方法。建立PC12细胞氧化(H2O2)损伤细胞模型,观察rhFGF12对氧化损伤细胞模型的保护作用,并从细胞水平阐明rhFGF12对氧化损伤神经细胞模型的保护作用机制。建立中枢神经系统损伤(MMF)的斑马鱼模型,以进一步观察rhFGF12对体内中枢损伤的保护作用。
方法:1.从GeneBank中获得FGF12基因序列,根据大肠杆菌的偏好合成具有两端限制酶位点的序列。将合成的靶基因序列连接到pET-3a载体以构建pET3a-hFGF12的重组质粒。通过测序及双酶切验证重组克隆载体并将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主细胞中。在16℃诱导24h后,通过离心收集菌体。通过Western印迹验证rhFGF12的表达情况。通过超声破碎处理菌株,并以SDS-PAGE验证rhFGF12蛋白可溶形式表达情况。
2.根据FGF12的理论等电点和肝素亲和力等特性,建立了基于离子交换层析和肝素亲和层析的蛋白质纯化方案。
3.获得高纯度重组蛋白后,采用MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3细胞和PC12细胞的促增殖生物学活性。
4.利用PC12细胞株,WesternBlot法研究蛋白对PC12细胞促增殖作用的机制。5.采取H2O2的氧化损伤细胞模型的方法,确定最适损伤时间及浓度,并测试不同浓度的rhFGF12蛋白质对细胞损伤模型细胞的体外保护作用。
6.通过WesternBlot在细胞分子层面分析rhFGF12对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护机制。
7.利用自带神经荧光的转基因斑马鱼品系(Islet)进行体内神经保护作用研究。MMF建立中枢神经损伤模型,进一步验证rhFGF12在体内对神经损伤保护的作用。
结果:1.合成FGF12基因序列,并与表达载体pET-3a相连接,通过测序确认得到阳性pET-3a-hFGF12重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中。在最佳诱导条件下,成功诱导rhFGF12以可溶形式表达。2.建立了离子交换和肝素亲和二步柱层析的纯化方案,得到了纯度较高的rhFGF12蛋白。
3.MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3和PC12细胞的促增殖活性。结果显示,rhFGF12蛋白明显促进NIH3T3细胞生长。此外,rhFGF12蛋白对PC12细胞也具有促增殖活性,有较好的敏感性和特异性。
4.进一步利用WesternBlot技术分析rhFGF12蛋白对PC12细胞的促生长机制。结果表明,与对照组相比,给药组的PCNA,p-ERK/ERK的表达水平明显增加,并存在剂量依赖性。
5.利用PC12细胞建立了氧化损伤细胞模型。通过MTT法证明了rhFGF12蛋白对氧化损伤细胞模型具有显著的保护作用。
6.WesternBlot法用于分析rhFGF12对氧化损伤细胞模型中信号通路相关蛋白Bax,Bcl-2,AKT和Caspase-3的影响。结果显示,与模型对照组相比,Bcl-2/Bax表达增加,p-AKT/AKT,c-caspase-3表达下降,与正常对照组相接近。
7.利用斑马鱼(Islet),建立了MMF中枢神经损伤模型。神经荧光成像显示,MMF损伤组神经发散荧光微弱,散裂。经MMF处理并给药rhFGF12组与损伤组相比,神经荧光较强,连接完整。在体内证明了rhFGF12对斑马鱼神经损伤模型的保护作用。
结论:通过大肠杆菌表达系统成功诱导rhFGF12蛋白的表达,并用阳离子交换层析和肝素亲和层析纯化获得活性较高的rhFGF12蛋白。在体外证实rhFGF12蛋白对H2O2诱导的PC12细胞凋亡具有显著的保护作用,并证明这种保护是通抗凋亡实现的。进一步建立斑马鱼MMF神经损伤模型,证明了rhFGF12在体内对神经损伤的保护作用。
方法:1.从GeneBank中获得FGF12基因序列,根据大肠杆菌的偏好合成具有两端限制酶位点的序列。将合成的靶基因序列连接到pET-3a载体以构建pET3a-hFGF12的重组质粒。通过测序及双酶切验证重组克隆载体并将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主细胞中。在16℃诱导24h后,通过离心收集菌体。通过Western印迹验证rhFGF12的表达情况。通过超声破碎处理菌株,并以SDS-PAGE验证rhFGF12蛋白可溶形式表达情况。
2.根据FGF12的理论等电点和肝素亲和力等特性,建立了基于离子交换层析和肝素亲和层析的蛋白质纯化方案。
3.获得高纯度重组蛋白后,采用MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3细胞和PC12细胞的促增殖生物学活性。
4.利用PC12细胞株,WesternBlot法研究蛋白对PC12细胞促增殖作用的机制。5.采取H2O2的氧化损伤细胞模型的方法,确定最适损伤时间及浓度,并测试不同浓度的rhFGF12蛋白质对细胞损伤模型细胞的体外保护作用。
6.通过WesternBlot在细胞分子层面分析rhFGF12对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护机制。
7.利用自带神经荧光的转基因斑马鱼品系(Islet)进行体内神经保护作用研究。MMF建立中枢神经损伤模型,进一步验证rhFGF12在体内对神经损伤保护的作用。
结果:1.合成FGF12基因序列,并与表达载体pET-3a相连接,通过测序确认得到阳性pET-3a-hFGF12重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中。在最佳诱导条件下,成功诱导rhFGF12以可溶形式表达。2.建立了离子交换和肝素亲和二步柱层析的纯化方案,得到了纯度较高的rhFGF12蛋白。
3.MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3和PC12细胞的促增殖活性。结果显示,rhFGF12蛋白明显促进NIH3T3细胞生长。此外,rhFGF12蛋白对PC12细胞也具有促增殖活性,有较好的敏感性和特异性。
4.进一步利用WesternBlot技术分析rhFGF12蛋白对PC12细胞的促生长机制。结果表明,与对照组相比,给药组的PCNA,p-ERK/ERK的表达水平明显增加,并存在剂量依赖性。
5.利用PC12细胞建立了氧化损伤细胞模型。通过MTT法证明了rhFGF12蛋白对氧化损伤细胞模型具有显著的保护作用。
6.WesternBlot法用于分析rhFGF12对氧化损伤细胞模型中信号通路相关蛋白Bax,Bcl-2,AKT和Caspase-3的影响。结果显示,与模型对照组相比,Bcl-2/Bax表达增加,p-AKT/AKT,c-caspase-3表达下降,与正常对照组相接近。
7.利用斑马鱼(Islet),建立了MMF中枢神经损伤模型。神经荧光成像显示,MMF损伤组神经发散荧光微弱,散裂。经MMF处理并给药rhFGF12组与损伤组相比,神经荧光较强,连接完整。在体内证明了rhFGF12对斑马鱼神经损伤模型的保护作用。
结论:通过大肠杆菌表达系统成功诱导rhFGF12蛋白的表达,并用阳离子交换层析和肝素亲和层析纯化获得活性较高的rhFGF12蛋白。在体外证实rhFGF12蛋白对H2O2诱导的PC12细胞凋亡具有显著的保护作用,并证明这种保护是通抗凋亡实现的。进一步建立斑马鱼MMF神经损伤模型,证明了rhFGF12在体内对神经损伤的保护作用。