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目的：通过基因工程技术构建并筛选获得高表达的rhFGF12工程菌株，建立可溶性形式表达rhFGF12蛋白的发酵工艺及纯化技术和蛋白活性测定方法。建立PC12细胞氧化（H2O2）损伤细胞模型，观察rhFGF12对氧化损伤细胞模型的保护作用，并从细胞水平阐明rhFGF12对氧化损伤神经细胞模型的保护作用机制。建立中枢神经系统损伤（MMF）的斑马鱼模型，以进一步观察rhFGF12对体内中枢损伤的保护作用。
方法：1.从GeneBank中获得FGF12基因序列，根据大肠杆菌的偏好合成具有两端限制酶位点的序列。将合成的靶基因序列连接到pET-3a载体以构建pET3a-hFGF12的重组质粒。通过测序及双酶切验证重组克隆载体并将其转化到BL21（DE3）pLysS宿主细胞中。在16℃诱导24h后，通过离心收集菌体。通过Western印迹验证rhFGF12的表达情况。通过超声破碎处理菌株，并以SDS-PAGE验证rhFGF12蛋白可溶形式表达情况。
2.根据FGF12的理论等电点和肝素亲和力等特性，建立了基于离子交换层析和肝素亲和层析的蛋白质纯化方案。
3.获得高纯度重组蛋白后，采用MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3细胞和PC12细胞的促增殖生物学活性。
4.利用PC12细胞株，WesternBlot法研究蛋白对PC12细胞促增殖作用的机制。5.采取H2O2的氧化损伤细胞模型的方法，确定最适损伤时间及浓度，并测试不同浓度的rhFGF12蛋白质对细胞损伤模型细胞的体外保护作用。
6.通过WesternBlot在细胞分子层面分析rhFGF12对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护机制。
7.利用自带神经荧光的转基因斑马鱼品系（Islet）进行体内神经保护作用研究。MMF建立中枢神经损伤模型，进一步验证rhFGF12在体内对神经损伤保护的作用。
结果：1.合成FGF12基因序列，并与表达载体pET-3a相连接，通过测序确认得到阳性pET-3a-hFGF12重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS中。在最佳诱导条件下，成功诱导rhFGF12以可溶形式表达。2.建立了离子交换和肝素亲和二步柱层析的纯化方案，得到了纯度较高的rhFGF12蛋白。
3.MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3和PC12细胞的促增殖活性。结果显示，rhFGF12蛋白明显促进NIH3T3细胞生长。此外，rhFGF12蛋白对PC12细胞也具有促增殖活性，有较好的敏感性和特异性。
4.进一步利用WesternBlot技术分析rhFGF12蛋白对PC12细胞的促生长机制。结果表明，与对照组相比，给药组的PCNA，p-ERK/ERK的表达水平明显增加，并存在剂量依赖性。
5.利用PC12细胞建立了氧化损伤细胞模型。通过MTT法证明了rhFGF12蛋白对氧化损伤细胞模型具有显著的保护作用。
6.WesternBlot法用于分析rhFGF12对氧化损伤细胞模型中信号通路相关蛋白Bax，Bcl-2，AKT和Caspase-3的影响。结果显示，与模型对照组相比，Bcl-2/Bax表达增加，p-AKT/AKT，c-caspase-3表达下降，与正常对照组相接近。
7.利用斑马鱼（Islet），建立了MMF中枢神经损伤模型。神经荧光成像显示，MMF损伤组神经发散荧光微弱，散裂。经MMF处理并给药rhFGF12组与损伤组相比，神经荧光较强，连接完整。在体内证明了rhFGF12对斑马鱼神经损伤模型的保护作用。
结论：通过大肠杆菌表达系统成功诱导rhFGF12蛋白的表达，并用阳离子交换层析和肝素亲和层析纯化获得活性较高的rhFGF12蛋白。在体外证实rhFGF12蛋白对H2O2诱导的PC12细胞凋亡具有显著的保护作用，并证明这种保护是通抗凋亡实现的。进一步建立斑马鱼MMF神经损伤模型，证明了rhFGF12在体内对神经损伤的保护作用。
方法：1.从GeneBank中获得FGF12基因序列，根据大肠杆菌的偏好合成具有两端限制酶位点的序列。将合成的靶基因序列连接到pET-3a载体以构建pET3a-hFGF12的重组质粒。通过测序及双酶切验证重组克隆载体并将其转化到BL21（DE3）pLysS宿主细胞中。在16℃诱导24h后，通过离心收集菌体。通过Western印迹验证rhFGF12的表达情况。通过超声破碎处理菌株，并以SDS-PAGE验证rhFGF12蛋白可溶形式表达情况。
2.根据FGF12的理论等电点和肝素亲和力等特性，建立了基于离子交换层析和肝素亲和层析的蛋白质纯化方案。
3.获得高纯度重组蛋白后，采用MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3细胞和PC12细胞的促增殖生物学活性。
4.利用PC12细胞株，WesternBlot法研究蛋白对PC12细胞促增殖作用的机制。5.采取H2O2的氧化损伤细胞模型的方法，确定最适损伤时间及浓度，并测试不同浓度的rhFGF12蛋白质对细胞损伤模型细胞的体外保护作用。
6.通过WesternBlot在细胞分子层面分析rhFGF12对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护机制。
7.利用自带神经荧光的转基因斑马鱼品系（Islet）进行体内神经保护作用研究。MMF建立中枢神经损伤模型，进一步验证rhFGF12在体内对神经损伤保护的作用。
结果：1.合成FGF12基因序列，并与表达载体pET-3a相连接，通过测序确认得到阳性pET-3a-hFGF12重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS中。在最佳诱导条件下，成功诱导rhFGF12以可溶形式表达。2.建立了离子交换和肝素亲和二步柱层析的纯化方案，得到了纯度较高的rhFGF12蛋白。
3.MTT法分别检测rhFGF12蛋白对NIH3T3和PC12细胞的促增殖活性。结果显示，rhFGF12蛋白明显促进NIH3T3细胞生长。此外，rhFGF12蛋白对PC12细胞也具有促增殖活性，有较好的敏感性和特异性。
4.进一步利用WesternBlot技术分析rhFGF12蛋白对PC12细胞的促生长机制。结果表明，与对照组相比，给药组的PCNA，p-ERK/ERK的表达水平明显增加，并存在剂量依赖性。
5.利用PC12细胞建立了氧化损伤细胞模型。通过MTT法证明了rhFGF12蛋白对氧化损伤细胞模型具有显著的保护作用。
6.WesternBlot法用于分析rhFGF12对氧化损伤细胞模型中信号通路相关蛋白Bax，Bcl-2，AKT和Caspase-3的影响。结果显示，与模型对照组相比，Bcl-2/Bax表达增加，p-AKT/AKT，c-caspase-3表达下降，与正常对照组相接近。
7.利用斑马鱼（Islet），建立了MMF中枢神经损伤模型。神经荧光成像显示，MMF损伤组神经发散荧光微弱，散裂。经MMF处理并给药rhFGF12组与损伤组相比，神经荧光较强，连接完整。在体内证明了rhFGF12对斑马鱼神经损伤模型的保护作用。
结论：通过大肠杆菌表达系统成功诱导rhFGF12蛋白的表达，并用阳离子交换层析和肝素亲和层析纯化获得活性较高的rhFGF12蛋白。在体外证实rhFGF12蛋白对H2O2诱导的PC12细胞凋亡具有显著的保护作用，并证明这种保护是通抗凋亡实现的。进一步建立斑马鱼MMF神经损伤模型，证明了rhFGF12在体内对神经损伤的保护作用。