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目的:1.对临床收集并鉴定为白念珠菌的菌株采用M27-A4微量肉汤稀释法进行体外药物敏感性试验,筛选出伊曲康唑耐药菌株和敏感菌株,并分析临床分离白念珠菌对唑类抗真菌药物伊曲康唑的耐药现状。2.通过PCR方法对临床分离白念珠菌伊曲康唑单一耐药菌株和氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均敏感菌株的毒力因子SAP2、转录因子GCN4进行生物学信息分析,初步明确SAP2、GCN4基因突变与伊曲康唑耐药的关系。3.制备临床分离白念珠菌体外生物膜模型,探讨白念珠菌伊曲康唑耐药与生物膜形成能力的关系。4.通过RT-PCR方法,检测游离状态和生物膜状态下临床分离白念珠菌SAP2、GCN4的m RNA表达水平,分析SAP2、GCN4在伊曲康唑耐药中的作用,并通过比较SAP2、GCN4的m RNA表达水平差异,初步明确临床分离伊曲康唑耐药白念珠菌中SAP2与GCN4是否存在相互调控作用。方法:1.收集2021年4月至7月山西医科大学第二医院药敏实验室初步筛选的可疑白念珠菌临床菌株75株,采用CHROMagar念珠菌显色培养基及分子生物学方法进一步鉴定;将鉴定后的菌株采用美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的M27-A4微量肉汤稀释法进行体外药物敏感性试验,判读、记录菌株的MIC50值,获得伊曲康唑耐药菌株和敏感菌株。2.选取课题组前期鉴定为伊曲康唑单一耐药白念珠菌菌株及氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均敏感白念珠菌菌株各10株(20株菌均来自痰液),分为耐药菌株组、敏感菌株组,提取20株临床分离菌株及标准菌株ATCC11006的DNA,通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增SAP2、GCN4基因片段后进行基因测序,寻找突变位点,并作统计分析。3.选取与第二部分实验相同的菌株,对两组菌株进行分离纯化后建立体外生物膜模型,于倒置显微镜下观察不同时段菌株的形态结构,使用酶标仪对两组菌株的生物膜形成能力进行测定,并对两组菌株的OD均值作统计分析。4.分别提取游离状态下及生物膜状态下两组菌株及标准菌株的总m RNA,并逆转录为c DNA,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)测定游离状态下和生物膜状态下SAP2、GCN4的m RNA表达水平,并作相应的统计分析。结果:1.75株临床菌株中共鉴定出白念珠菌70株,其中伊曲康唑耐药菌株24株,敏感菌株46株,本实验中的菌株对伊曲康唑耐药占比为34.3%。2.耐药菌株组和敏感菌株组白念珠菌SAP2、GCN4基因测序结果:两组菌株SAP2基因均未发现突变位点;在GCN4基因中发现1个错义突变位点A106T(T36S),错义突变仅出现在4株耐药菌株中,敏感菌株未出现错义突变。3.生物膜形态结构:倒置显微镜下可以明显观察到随着时间的增加,白念珠菌细胞及菌丝不断增多,细胞沿菌丝聚集,形成完整的膜状结构;生物膜形成能力测定结果显示:耐药菌株组的OD值(0.42±0.07)高于敏感菌株组的OD值(0.23±0.04),差异具有统计学意义(P<0.05)。4.RT-PCR检测结果:(1)游离状态下,耐药菌株组SAP2 m RNA表达水平(1.12±1.06)高于敏感菌株组(0.30±0.33),差异具有统计学意义(P<0.05);耐药菌株组GCN4 m RNA表达水平(1.86±1.24)高于敏感菌株组(0.49±0.23),差异具有统计学意义(P<0.05);SAP2和GCN4在转录水平上呈正相关关系(r=0.693,P<0.05)。(2)生物膜状态下,耐药菌株组SAP2 m RNA表达水平(8.12±5.68)高于敏感菌株组(4.75±2.58),P>0.05,差异无统计学意义;耐药菌株组GCN4 m RNA表达水平(5.02±5.82)高于敏感菌株组(1.83±2.23),差异具有统计学意义(P<0.05);SAP2和GCN4在转录水平上呈正相关关系(r=0.622,P<0.05)。(3)生物膜状态下SAP2 m RNA表达水平(5.39±6.06)高于游离状态(0.50±0.89),差异具有显著统计学意义(P<0.001);生物膜状态下GCN4 m RNA表达水平(3.35±3.35)高于游离状态(0.89±1.42),差异具有显著统计学意义(P<0.001)。结论:1.临床白念珠菌感染患者对伊曲康唑耐药率相对较高;因此,临床上选择治疗白念珠菌感染药物时需以药敏试验结果为指导。2.临床分离白念珠菌SAP2基因未发现突变位点,可能与白念珠菌伊曲康唑耐药无关;白念珠菌伊曲康唑耐药可能与GCN4基因突变(T36S)有关,但需进一步研究证实;3.临床分离白念珠菌生物膜的形成可能增加其对伊曲康唑耐药。4.游离状态下及生物膜状态下,临床分离白念珠菌GCN4 m RNA高表达均可能增加伊曲康唑耐药性;游离状态下,临床分离白念珠菌SAP2 m RNA高表达可能增加伊曲康唑耐药性;不同状态下,临床分离白念珠菌中SAP2与GCN4 m RNA表达水平均呈正相关。