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硫在生命起源中起到了非常重要的作用,复杂多样且化学性质活跃的含硫化合物,是地球生物化学循环必不可少的元素,在生物体新陈代谢过程中具有重要的作用。硫氧化是硫元素在生物地球化学循环中的重要组成部分,通常是指单质硫或还原性硫化物被微生物氧化的过程。硫化物氧化的过程中,会形成多硫化物、硫代硫酸盐等中间产物,但其最终产物一般是硫酸盐,产生的硫酸盐最后会汇入到生态系统中被再次利用。
硫化物尤其是H2S,具有极强的穿透细胞膜的能力,可对生物的多种代谢过程产生毒性效应。然而,除了其毒性,20世纪90年代末,H2S被证实是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后,存在于生物体内的第三个气体信号分子。H2S通过作用于离子通道、某些转录因子、激酶等,参与了机体内的多种生理过程。
除了自然界中火山喷发、热泉口释放等活动及人为的工业过程活动所产生的外源性H2S外,生物体内含硫氨基酸的代谢则是H2S的内源产生途径,而这一过程主要涉及胱硫醚吖一裂解酶(CSE),胱硫醚-β-合成酶(CBS)以及3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)三种酶。由于硫化物的双重作用,富硫环境中的生物发展出了特定的H2S代谢调控机制来严格控制体内H2S的浓度,使其在细胞内维持一个较低的水平。
生物体内由酶催化所产生的H2S的生物氧化途径以硫醌氧化还原酶(SQR)、硫转移酶(RHOD)及过硫化物双加氧酶(PDO)为主,这一氧化途径在一些自养菌、异养菌及哺乳动物线粒体中均有存在。首先,SQR能够将硫化物氧化形成多硫化物,然后,在RHOD的作用下,把多硫化物中硫烷形式的硫转移给谷胱甘肽(GSH)形成谷胱甘肽过硫化物(GSSH),GSSH在PDO的作用下,将GSSH氧化成亚硫酸盐并再生GSH,生成的亚硫酸盐会和过量的多硫化物自发反应形成硫代硫酸盐。
SQR作为硫化物氧化途径的第一个酶,催化硫化氢到硫烷硫的转化,在整个硫代谢系统中起着十分重要的作用。该蛋白广泛分布在于动物线粒体和微生物中,在植物中很少见。根据结构和序列分析,SQRs被分为六种类型。然而,目前对SQR的研究多集中于自养菌中SQRs的动力学参数及蛋白结构解析,Aquifex aeolicus中的SQR通过x晶体衍射确定为一个完整的单体膜蛋白,带有一个两亲的螺旋一转角一螺旋基序以12A的距离插入到质膜中,但没有明确插入到了质膜的哪一侧。只有荚膜红细菌中SQR明确了其周质定位,而没有任何关于异养细菌SQR结构及其定位的报导。同时,关于PDOs在化能无机化硫杆菌Acidithiobacillus spp.中的周质定位也是存在争议的,因为没有发现它们的信号肽序列。基于以上背景,通过序列分析及基因融合技术对异养细菌C.pinatubonens括JMPl34中SQR及PDO进行了亚细胞定位分析。
C.pinatubonensis JMPl34中的SQR(CpSQR)的1-128位氨基酸为N端的DUF442结构域,158-554位氨基酸为C端的SQR结构域,它在147.175、213-219、343.358及150-170位氨基酸之间存在四个潜在的跨膜区域,被预测有可能穿过细胞质膜,另外,在SQR的30,62,84,107,和125位氨基酸前存在一个非典型的α螺旋。首先,通过对细胞裂解液、膜组分及可溶性蛋白三种组分硫化氢的氧化分析、以及SDS.PAGE及融合蛋白荧光成像等方法明确了CpSQR的膜定位。使用不同长度的SQR片段与报告基因PhoA/GFP构建了fragment。-PhoA/GFP融合蛋白各13个。酶活检测发现fragment。-PhoA融合蛋白没有监测到碱性磷酸酶活性,而fragment。-GFP融合蛋白均有荧光蛋白的表达,鉴于DUF442是一个可溶蛋白(结构域),所以,将SQRs确定为膜周边蛋白。由于CpPDO2没有用于跨膜的信号肽,其催化活性需要亚铁离子(Fe2-)参与且可以大量纯化,推测它是一种胞质蛋白。在PDO-PhoA/GFP融合蛋白表达菌株中未检测到碱性磷酸酶活性,只有荧光蛋白表达,证明PDO并非周质蛋白,而是一种胞质蛋白。令人意外的是,荧光成像检测发现PDO-GFP融合蛋白表达菌株的荧光沿外围分布,进一步对其他PDOs-GFP融合蛋白进行检测也是同样的发现,表明这可能是PDOs蛋白的固有属性,因为很多重要的胞质蛋白可能会通过两性螺旋或疏水斑块与细胞膜相互作用。综上,明确了C.pinatubonens&JMP134中的SQR是一个膜周边蛋白且朝向胞质一侧,CpPD02是一种细胞质可溶性蛋白,且倾向于沿细胞膜分布,这种靠近细胞膜的位置分布可能缩短了硫化物氧化通路,使细菌能够快速进行硫化物解毒,生成硫代硫酸盐。
进一步,研究了C.pinatubonensis JMP134中硫代硫酸盐的氧化系统一-Sox系统的功能。Sox系统,是一个由多个酶组成的能够进行无机硫化合物代谢的多酶复合体,以周质空间蛋白SoxYZ,SoxXA,SoxB和SoxCD为核心构成,在自养菌Paracoccuspantotrophus GBl7的研究中最具有代表性。Sox系统氧化硫代硫酸盐时,首先在SoxXA的帮助下,硫代硫酸盐与SoxYZ复合物中SoxY蛋白上的保守半胱氨酸残基相结合,形成SoxZY-S-SSO3-,然后SoxB水解该加合物并释放1分子硫酸盐,产生SoxZY-S-S-,随后SoxCD脱氢氧化SoxZY-S-S-上的零价硫,产生SoxZY-S-SO3-,再次经SoxB的水解,将SoxZY-S-SO3-上的磺基(-SO3。)氧化成硫酸盐,并同时释放出SoxZY-S-进行下一轮的循环。C.pinambonensis JMP134具有完整的Sox系统核心蛋白,分布在A染色体上,由基因簇soxR-soxC-soxD-Cyc-soxY-soxZ-hyp-soxA-soxX-TrxA.soxB编码。首先分析了Sox系统核心蛋白敲除株对硫代硫酸盐代谢的影响,发现敲除SoxYZ,SoxXA,SoxB后,菌株完全失去了氧化硫代硫酸盐的能力,而敲除SoxCD后,菌株仍可以缓慢的代谢硫代硫酸盐。然后,又分析了Sox系统对硫化氢及多硫化物的代谢情况。由于C.pinatubonensis JMPl34中的SQR及FCSDs(SoxEF)具有氧化硫化氢的能力,PDO1及PDO2具有氧化多硫化物的能力,因此构建了不同背景的敲除菌株进行实验。在敲除了SQR、PDO1、PDO2及SoxF的菌株(Cp4K)、Cp4K△soxYZ两株菌及Cp△pdo12、Cp△pdo12AsoxCD敲除株中,并未检测到显著的硫化氢或多硫化物氧化差异,说明正常条件下Sox系统不能进行外源添加的硫化氢及多硫化物的氧化。综合表明C.pinatubonensis JMP134中的Sox系统主要作用是氧化硫代硫酸盐,并不是氧化硫化氢及多硫化物。
最后,对C.pinatubonensis JMP134中flqSox系统进行了转录调控分析。在基因soxC的上游有一个编码ArsR家族转录因子的soxR基因。SoxR蛋白只有一个HTH DNA结合结构域,敲除该结构域后,得NsoxR敲除株CpAsoxR。通过分析各个菌株对硫代硫酸盐的代谢,发现Cp△soxR明显加速了硫代硫酸盐的代谢,同时qPCR分析发现在Cp△soxR中,基因soxC的表达明显地上调,表明了SoxR蛋白可能是一个转录抑制因子,抑制了下游硫代硫酸盐代谢基因(Sox系统)的表达。共转录分析发现soxR基因与其下游的10+sox基因位于同一个转录本上;通过5‘-RACE实验确定了基因soxR的转录起始位点是位于其上游-26bp处的鸟嘌呤G处;通过凝胶迁移实验(EMSA)实验发现SoxR蛋白与转录起始位点下游的回文序列相结合。通过构建启动子序列与调控蛋白的荧光报告系统,发现除硫代硫酸外,硫化氢、多硫化物、丙酮硫、连四硫酸盐均能增强荧光蛋白的表达。同时,报告系统的荧光强度随着这些化合物浓度的S曾Dll逐渐增强且两者之间的关系可通过Hill方程进行拟合。但是,当在体外进行EMsA实验,验证这些化合物对SoxR蛋白结合DNA的影响时,发现只有多硫化物、丙酮硫起到了显著的作用,使DNA从SoxR蛋白上解离下来,这表明硫代硫酸盐不与SoxR蛋白直接作用,直接起作用的可能是硫烷硫。同时,还发现SoxR蛋白的第43位及98位半胱氨酸与信号响应有关,因为这两个半胱氨酸突变之后,硫代硫酸盐不能增强荧光蛋白的表达。虽然异养细菌C.pinatubonens括JMP134中的SoxR与自养细菌尸pantotrophus GB7和P salicylatoxidans KCT001中的SoxR序列相似性不高,但都属于ArsR家族中的一种翼状螺旋-转角-螺旋抑制因子亚家族,没有金属离子结合位点,受硫代硫酸盐诱导但并不直接与蛋白相互作用,只是CpSoxR只有-个DNA结合位点,而PpSoxR及PsSoxR贝0分别有两个DNA结合位点。以上实验结果说明异养细菌C.pinatubonensis JMP134中Sox的调控方式与自养细菌C.pantotrophus GB7和P.salicylatoxidans KCT001中类似,均受到ArsR家族转录因子SoxR的抑制,而硫代硫酸盐可以解除该抑制作用,启动下游基因表达,加速硫代硫酸盐的代谢。
硫化物尤其是H2S,具有极强的穿透细胞膜的能力,可对生物的多种代谢过程产生毒性效应。然而,除了其毒性,20世纪90年代末,H2S被证实是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后,存在于生物体内的第三个气体信号分子。H2S通过作用于离子通道、某些转录因子、激酶等,参与了机体内的多种生理过程。
除了自然界中火山喷发、热泉口释放等活动及人为的工业过程活动所产生的外源性H2S外,生物体内含硫氨基酸的代谢则是H2S的内源产生途径,而这一过程主要涉及胱硫醚吖一裂解酶(CSE),胱硫醚-β-合成酶(CBS)以及3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)三种酶。由于硫化物的双重作用,富硫环境中的生物发展出了特定的H2S代谢调控机制来严格控制体内H2S的浓度,使其在细胞内维持一个较低的水平。
生物体内由酶催化所产生的H2S的生物氧化途径以硫醌氧化还原酶(SQR)、硫转移酶(RHOD)及过硫化物双加氧酶(PDO)为主,这一氧化途径在一些自养菌、异养菌及哺乳动物线粒体中均有存在。首先,SQR能够将硫化物氧化形成多硫化物,然后,在RHOD的作用下,把多硫化物中硫烷形式的硫转移给谷胱甘肽(GSH)形成谷胱甘肽过硫化物(GSSH),GSSH在PDO的作用下,将GSSH氧化成亚硫酸盐并再生GSH,生成的亚硫酸盐会和过量的多硫化物自发反应形成硫代硫酸盐。
SQR作为硫化物氧化途径的第一个酶,催化硫化氢到硫烷硫的转化,在整个硫代谢系统中起着十分重要的作用。该蛋白广泛分布在于动物线粒体和微生物中,在植物中很少见。根据结构和序列分析,SQRs被分为六种类型。然而,目前对SQR的研究多集中于自养菌中SQRs的动力学参数及蛋白结构解析,Aquifex aeolicus中的SQR通过x晶体衍射确定为一个完整的单体膜蛋白,带有一个两亲的螺旋一转角一螺旋基序以12A的距离插入到质膜中,但没有明确插入到了质膜的哪一侧。只有荚膜红细菌中SQR明确了其周质定位,而没有任何关于异养细菌SQR结构及其定位的报导。同时,关于PDOs在化能无机化硫杆菌Acidithiobacillus spp.中的周质定位也是存在争议的,因为没有发现它们的信号肽序列。基于以上背景,通过序列分析及基因融合技术对异养细菌C.pinatubonens括JMPl34中SQR及PDO进行了亚细胞定位分析。
C.pinatubonensis JMPl34中的SQR(CpSQR)的1-128位氨基酸为N端的DUF442结构域,158-554位氨基酸为C端的SQR结构域,它在147.175、213-219、343.358及150-170位氨基酸之间存在四个潜在的跨膜区域,被预测有可能穿过细胞质膜,另外,在SQR的30,62,84,107,和125位氨基酸前存在一个非典型的α螺旋。首先,通过对细胞裂解液、膜组分及可溶性蛋白三种组分硫化氢的氧化分析、以及SDS.PAGE及融合蛋白荧光成像等方法明确了CpSQR的膜定位。使用不同长度的SQR片段与报告基因PhoA/GFP构建了fragment。-PhoA/GFP融合蛋白各13个。酶活检测发现fragment。-PhoA融合蛋白没有监测到碱性磷酸酶活性,而fragment。-GFP融合蛋白均有荧光蛋白的表达,鉴于DUF442是一个可溶蛋白(结构域),所以,将SQRs确定为膜周边蛋白。由于CpPDO2没有用于跨膜的信号肽,其催化活性需要亚铁离子(Fe2-)参与且可以大量纯化,推测它是一种胞质蛋白。在PDO-PhoA/GFP融合蛋白表达菌株中未检测到碱性磷酸酶活性,只有荧光蛋白表达,证明PDO并非周质蛋白,而是一种胞质蛋白。令人意外的是,荧光成像检测发现PDO-GFP融合蛋白表达菌株的荧光沿外围分布,进一步对其他PDOs-GFP融合蛋白进行检测也是同样的发现,表明这可能是PDOs蛋白的固有属性,因为很多重要的胞质蛋白可能会通过两性螺旋或疏水斑块与细胞膜相互作用。综上,明确了C.pinatubonens&JMP134中的SQR是一个膜周边蛋白且朝向胞质一侧,CpPD02是一种细胞质可溶性蛋白,且倾向于沿细胞膜分布,这种靠近细胞膜的位置分布可能缩短了硫化物氧化通路,使细菌能够快速进行硫化物解毒,生成硫代硫酸盐。
进一步,研究了C.pinatubonensis JMP134中硫代硫酸盐的氧化系统一-Sox系统的功能。Sox系统,是一个由多个酶组成的能够进行无机硫化合物代谢的多酶复合体,以周质空间蛋白SoxYZ,SoxXA,SoxB和SoxCD为核心构成,在自养菌Paracoccuspantotrophus GBl7的研究中最具有代表性。Sox系统氧化硫代硫酸盐时,首先在SoxXA的帮助下,硫代硫酸盐与SoxYZ复合物中SoxY蛋白上的保守半胱氨酸残基相结合,形成SoxZY-S-SSO3-,然后SoxB水解该加合物并释放1分子硫酸盐,产生SoxZY-S-S-,随后SoxCD脱氢氧化SoxZY-S-S-上的零价硫,产生SoxZY-S-SO3-,再次经SoxB的水解,将SoxZY-S-SO3-上的磺基(-SO3。)氧化成硫酸盐,并同时释放出SoxZY-S-进行下一轮的循环。C.pinambonensis JMP134具有完整的Sox系统核心蛋白,分布在A染色体上,由基因簇soxR-soxC-soxD-Cyc-soxY-soxZ-hyp-soxA-soxX-TrxA.soxB编码。首先分析了Sox系统核心蛋白敲除株对硫代硫酸盐代谢的影响,发现敲除SoxYZ,SoxXA,SoxB后,菌株完全失去了氧化硫代硫酸盐的能力,而敲除SoxCD后,菌株仍可以缓慢的代谢硫代硫酸盐。然后,又分析了Sox系统对硫化氢及多硫化物的代谢情况。由于C.pinatubonensis JMPl34中的SQR及FCSDs(SoxEF)具有氧化硫化氢的能力,PDO1及PDO2具有氧化多硫化物的能力,因此构建了不同背景的敲除菌株进行实验。在敲除了SQR、PDO1、PDO2及SoxF的菌株(Cp4K)、Cp4K△soxYZ两株菌及Cp△pdo12、Cp△pdo12AsoxCD敲除株中,并未检测到显著的硫化氢或多硫化物氧化差异,说明正常条件下Sox系统不能进行外源添加的硫化氢及多硫化物的氧化。综合表明C.pinatubonensis JMP134中的Sox系统主要作用是氧化硫代硫酸盐,并不是氧化硫化氢及多硫化物。
最后,对C.pinatubonensis JMP134中flqSox系统进行了转录调控分析。在基因soxC的上游有一个编码ArsR家族转录因子的soxR基因。SoxR蛋白只有一个HTH DNA结合结构域,敲除该结构域后,得NsoxR敲除株CpAsoxR。通过分析各个菌株对硫代硫酸盐的代谢,发现Cp△soxR明显加速了硫代硫酸盐的代谢,同时qPCR分析发现在Cp△soxR中,基因soxC的表达明显地上调,表明了SoxR蛋白可能是一个转录抑制因子,抑制了下游硫代硫酸盐代谢基因(Sox系统)的表达。共转录分析发现soxR基因与其下游的10+sox基因位于同一个转录本上;通过5‘-RACE实验确定了基因soxR的转录起始位点是位于其上游-26bp处的鸟嘌呤G处;通过凝胶迁移实验(EMSA)实验发现SoxR蛋白与转录起始位点下游的回文序列相结合。通过构建启动子序列与调控蛋白的荧光报告系统,发现除硫代硫酸外,硫化氢、多硫化物、丙酮硫、连四硫酸盐均能增强荧光蛋白的表达。同时,报告系统的荧光强度随着这些化合物浓度的S曾Dll逐渐增强且两者之间的关系可通过Hill方程进行拟合。但是,当在体外进行EMsA实验,验证这些化合物对SoxR蛋白结合DNA的影响时,发现只有多硫化物、丙酮硫起到了显著的作用,使DNA从SoxR蛋白上解离下来,这表明硫代硫酸盐不与SoxR蛋白直接作用,直接起作用的可能是硫烷硫。同时,还发现SoxR蛋白的第43位及98位半胱氨酸与信号响应有关,因为这两个半胱氨酸突变之后,硫代硫酸盐不能增强荧光蛋白的表达。虽然异养细菌C.pinatubonens括JMP134中的SoxR与自养细菌尸pantotrophus GB7和P salicylatoxidans KCT001中的SoxR序列相似性不高,但都属于ArsR家族中的一种翼状螺旋-转角-螺旋抑制因子亚家族,没有金属离子结合位点,受硫代硫酸盐诱导但并不直接与蛋白相互作用,只是CpSoxR只有-个DNA结合位点,而PpSoxR及PsSoxR贝0分别有两个DNA结合位点。以上实验结果说明异养细菌C.pinatubonensis JMP134中Sox的调控方式与自养细菌C.pantotrophus GB7和P.salicylatoxidans KCT001中类似,均受到ArsR家族转录因子SoxR的抑制,而硫代硫酸盐可以解除该抑制作用,启动下游基因表达,加速硫代硫酸盐的代谢。