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研究目的:
1、观察耐药大肠杆菌外膜通透性变化;
2、观察中药复方清热颗粒原液、含药血清、中西药结合对耐药大肠杆菌外膜通透性的干预作用。
研究方法:
1、大肠杆菌外膜蛋白提取:选取大肠杆菌ATCC35218(产β—内酰胺酶标准株)、ATCC25922(标准敏感质控株)和临床产超广谱β—内酰胺酶大肠杆菌ESBL1、ESBL2四株菌株,行增菌培养,提取外膜蛋白,行蛋白电泳,紫外凝胶成像后分析外膜蛋白的相对含量来反映外膜通透性的变化。
2、药敏试验:采用琼脂稀释法分别对中药原液、含药血清、西药舒普深、空白血清以及中药原液+舒普深、含药血清+舒普深等各组进行药敏试验,测定各组药对大肠杆菌ATCC35218、ESBL1、ESBL2的最低抑菌浓度(MIC),质控菌株为大肠杆菌ATCC25922。各药物作用后,再次测定各菌株对舒普深的MIC值以反映耐药性的变化。
3、含药血清的制备:采用腹腔注射大肠杆菌ATCC35218建立急性耐药菌腹腔感染兔模型,成模后开始每日2次灌胃给中药复方清热颗粒剂,5天后心脏采血提取含药血清。健康兔每日灌入等量生理盐水,提取空白血清作为对照。
实验结果:
1、各菌株外膜蛋白变化:大肠杆菌ATCC35218(产β—内酰胺酶株)、大肠杆菌ATCC25922(标准敏感质控株)和临床产ESBL大肠杆菌ESBL1均含有外膜蛋白OmpC、OmpF和OmpA,而ESBL2缺失OmpF,仅有OmpA和OmpC。大肠杆菌ATCC25922、ATCC35218、ESBL1、ESBL2对舒普深的MIC值分别为1ug/ml,2ug/ml,16ug/ml,64ug/ml,即耐药性逐渐增加。说明外膜蛋白OmpF的缺失可能为增加大肠杆菌的耐药性的原因之一。
2、中药的干预作用:
(1)舒普深+含药血清作用后,能使四株大肠杆菌外膜蛋白OmpF含量增加(P<0.05),即外膜通透性增加,且药物作用后大肠杆菌的MIC值下降(P<0.05),即耐药性下降。
(2)舒普深+中药原液作用后,能使大肠杆菌ATCC35218(产β—内酰胺酶株)、大肠杆菌ATCC25922(标准敏感质控株)、临床产ESBL大肠杆菌ESBL1的外膜蛋白OmpF含量增加(P<0.05),即外膜通透性增加,且药物作用后大肠杆菌的MIC值下降(P<0.05),即耐药性下降。
(3)中药原液能使大肠杆菌ATCC25922(标准敏感质控株)外膜蛋白OmpF含量增加(P<0.05),即外膜通透性增加,且药物作用后大肠杆菌的MIC值下降(P<0.05),即耐药性下降。
(4)单纯含药血清作用后四株大肠杆菌的外膜OmpF含量无增加,且含药血清作用后大肠杆菌的MIC值无变化(P>0.05),即耐药性无变化。
(5)大肠杆菌耐药性的变化可能与外膜通透性的变化有关,耐药性的下降与外膜通透性的增加一致(相关系数r=-0.436,p=0.02)。
结论:
1、耐药大肠杆菌的外膜蛋白OmpF缺失,即外膜通透性的降低,为其耐药性增加的一种机制之一。
2、大肠杆菌耐药性的下降可能与其外膜通透性的增加有关。
3、含药血清联合舒普深能增加四株大肠杆菌的外膜蛋白OmpF的含量,从而能增加各菌株的外膜通透性;中药原液联合舒普深能增加大肠杆菌ATCC35218(产β—内酰胺酶标准株)、大肠杆菌ATCC25922(标准敏感质控株)、临床产ESBL大肠杆菌ESBL1的外膜蛋白OmpF的含量,从而增加其外膜通透性;中药原液能增加大肠杆菌ATCC25922和ESBL1的外膜蛋白OmpF的含量,从而增加其外膜通透性。含药血清对四株大肠杆菌无作用。