研究背景:近年来我国肾癌的发病率呈上升趋势,肾癌的发生发展是一个多因素不断相互作用的过程,它的确切病因尚不明确,目前,肾癌最重要的治疗方法是手术治疗,手术治疗可以明显提高患者的生存率。虽然随着诊断及治疗水平的提高,肾癌预后情况较前有了明显的改善,但是仍有部分患者会出现肿瘤的复发甚至进展转移等。既往研究表明,恶性肿瘤的发生与免疫功能障碍相关,肾癌是一种高度免疫原性癌症。近年来,免疫治疗成为了晚期肾癌的一种新兴治疗方式,尽管显示了一定的治疗效果,但由于耐药等情况的发生,尚不能完全控制和治愈肿瘤。因此,有必要对肾癌的免疫机制进一步研究,分析其中的肿瘤免疫微环境状况。在肿瘤微环境中,发挥重要作用的有免疫系统,由免疫系统参与调控的肿瘤微环境称为肿瘤免疫微环境,肿瘤浸润淋巴细胞在肿瘤免疫微环境中起着关键作用,其中发挥肿瘤杀伤功能较重要的一类肿瘤浸润淋巴细胞是T淋巴细胞,T淋巴细胞通过TCR识别抗原呈递细胞所呈递的抗原是启动其生物学效应的重要步骤,因此,研究T细胞受体的功能特征和免疫学机制对理解肿瘤免疫有着重要的意义。人体内TCR主要是αβTCR,其中,β链是TCR组库研究的主要肽链,这是因为β链（VDJ基因片段中D基因片段的主要成分）与α链相比具有更高的组合潜力,其多样性更为复杂。TCRα链和β链分别由胞外区和胞内区构成,胞外区有2个结构域部分,其中氨基端的氨基酸序列变化非常大,称为可变区,其内包含了互补决定区,共有3个互补决定区,分别是CDR1、CDR2、CDR3;在这3个互补决定区中,变异度最大的是CDR3,TCR发挥抗原特异性识别的功能主要依靠它。T细胞经过抗原的刺激然后增殖、活化成一群T淋巴细胞克隆,这些T淋巴细胞的TCR是完全相同的。T淋巴细胞接触不同的抗原时,TCR组库中特定的受体与之结合,当抗原持续存在时,使得具有特定TCR的T淋巴细胞不断增生,即发生抗原驱动下的克隆性增生。所以,从TCR组库的多样性中能够了解人体发生的免疫应答以及多样的免疫反应,这对于研究肿瘤的免疫分子机制是非常关键的。已有研究表明,TCR组库在肿瘤等多种疾病的诊断、治疗、预后方面均具有重要的作用。研究疾病的TCR组库的特点可以认识患者体内的免疫应答情况,对T细胞受体多态性的研究,可以对人体的免疫功能状态有更加深入的分析,筛选出与疾病有特异性关系的基因片段及氨基酸序列,可以帮助选取针对不用疾病状态的最佳治疗方法,判断治疗效果及估计预后等,还可以鉴定疾病特异性的T细胞克隆从而使用免疫治疗。以往对肾癌TCR组库的研究主要集中在CD4+/CD8+肿瘤浸润性T淋巴细胞的表型和功能特性上,以及癌组织和外周血单个核细胞免疫组库的比较,涉及肾癌癌组织和癌旁正常肾组织TCR免疫组库的研究很少,对于癌组织和癌旁组织TCR CDR3的相关特点认识尚不足,因此有必要对癌组织和癌旁组织TCR CDR3的特点进一步研究。研究目的:本研究目的在于分析肾癌的癌组织与癌旁组织TCR的多样性和克隆表达差异性,采用高通量测序技术分析肾癌组织和癌旁组织中T细胞受体克隆多样性及其克隆序列。研究方法:（1）收集肾癌组织和癌旁组织,提取组织RNA;（2）使用5’RACE和巢式PCR方法扩增TCR CDR3;（3）构建测序文库;（4）高通量测序（5）分析癌组织、癌旁组织的Vβ、Jβ基因片段、V-D-J基因组合、TCR CDR3的多样性。研究结果:（1）TCR组库Vβ、Jβ基因片段使用模式的分析癌组织和癌旁组织的所有样本都识别出13种Jβ基因片段。62种Vβ基因片段分别属于29种Vβ基因亚家族,13种Jβ基因片段分别属于2种Jβ基因家族,比较癌组织和癌旁组织使用Vβ基因种类的差异,癌组织的Vβ基因种类数量和癌旁组织的Vβ基因种类数量无明显差异。癌组织和癌旁组织两组样本Vβ、Jβ基因使用模式总体相似。在一些样本中存在某些高频率使用的Vβ基因片段和Jβ基因片段。各个样本中大部分基因使用频率都小于5%。共有4种Vβ基因片段在癌组织和癌旁组织中的使用频率有统计学差异,分别为 TRBV5-5、TRBV7-7、TRBV9、TRBV25-1,仅有 TRBJ2-5基因片段使用频率有差异。（2）癌组织、癌旁组织的V-D-J基因组合分析癌旁组织的平均Simpson指数和NSDE值均高于癌组织,表明癌旁组织V-D-J基因组合使用模式的多样性高于癌组织,但两者无明显统计学差异。每个配对样本癌组织和癌旁组织的MHSI平均值是0.28,大多数配对样本间MHSI值低于0.3,癌组织和癌旁组织之间V-D-J基因组合使用模式的相似度较低。癌组织和癌旁组织V-D-J基因组合数有统计学差异。（3）癌组织及癌旁组织TRB CDR3的多样性分析1)癌组织与癌旁组织中TRB CDR3氨基酸（CDR3 aa）克隆型的数量差异癌组织中CDR3氨基酸克隆型中位数为3804[3110-7459),癌旁组织CDR3氨基酸克隆型中位数为2038[1177-3710],癌组织的CDR3氨基酸克隆型数量大于癌旁组织的,但两者无明显统计学差异。2)癌组织与癌旁组织TRB CDR3氨基酸长度的分布特点对TRB CDR3氨基酸克隆长度分布进行分析（图3-8）,大部分样本的CDR3氨基酸序列长度为5-30个氨基酸,各个样本使用较多的氨基酸长度范围为11-18。癌组织的前5位氨基酸克隆使用频率之和高于癌旁组织的。癌组织或癌旁组织CDR3氨基酸可能出现了克隆性增生。3)癌组织及癌旁组织的高扩增性克隆分析癌组织和癌旁组织HEC平均数分别是120、152个,癌组织和癌旁组织的总体HEC个数无明显统计学差异。4)癌组织与癌旁组织TRB CDR3氨基酸多态性的比较Simpson指数和NSDE值二者均为癌组织的低于癌旁组织的,癌组织的CDR3氨基酸使用多样性低于癌旁组织的,但无明显统计学差异。5)癌组织及癌旁组织TRB CDR3氨基酸的共有克隆和相似性分析在癌组织或癌旁组织的所有样本中,随着样本数量的增加,共有的CDR3氨基酸克隆型比例明显降低,共有克隆性均非常低;每对癌组织与配对癌旁组织样本的共有克隆也都较低,表明癌组织或癌旁组织中不同样本间共有克隆均非常低。6)癌组织及癌旁组织TCRCDR3氨基酸使用频率的相似性每对癌组织和癌旁组织的MHSI值中位数为0.035,大多数样本值低于0.03;表明癌组织和癌旁组织两者TCR CDR3氨基酸使用频率的相似程度低。7)癌组织与癌旁组织TCR CDR3氨基酸使用的主成分分析对CDR3氨基酸的频率进行主成分计算（频率按样本进行标准化）,取第一、二位的主成分值进行作图。癌组织和癌旁组织不能完全区分为两群,各样本之间主成分值有差异。8)肿瘤相关CDR3氨基酸克隆型的分析对于每一种CDR3氨基酸的克隆型,分别计算其出现在癌组织和癌旁组织样本中的数量,当癌组织的样本数量高于癌旁组织样本数量,认为该CDR3氨基酸克隆型可能是与肿瘤相关的CDR3氨基酸克隆型,共识别出17种肿瘤特异性CDR3氨基酸克隆型,推测可能与肿瘤抗原相关。9)癌组织与癌旁组织TCRCDR3的多态性与临床预后的关系比较癌组织不同临床分期的NSDE值进行临床预后分析。以临床分期进行分组,Ⅱ期患者NSDE略高于Ⅰ期和Ⅲ期期患者,三者之间无明显统计学差异,癌组织TCRCDR3的多态性与临床预后无明显关系。研究结论:1.肾癌组织和癌旁组织Vβ、Jβ基因使用模式总体相似,存在有统计学差异的Vβ、Jβ基因片段。2.肾癌组织的TCR CDR3氨基酸多样性低于癌旁组织的,癌组织与癌旁组织的TCR CDR3氨基酸的相似性低。3.肾癌组织与癌旁组织分别具有特定的TCR CDR3氨基酸使用模式。