灵猫方干预BCP区突变乙肝病毒转基因小鼠模型的药物机制研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:guohl_sh
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目的:  基于BCP区突变的HBV转基因小鼠模型研究中药灵猫方干预慢性乙型肝炎的作用及机制。  方法:  1.基于PiggyBac转座子系统,引入BCP区突变的HBV病毒株,构建HBV转基因小鼠模型;ELISA及实时荧光定量PCR检测各代HBV转基因小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)表达和HBV DNA水平;HE染色、免疫组化染色方法观察小鼠肝组织的病理变化。  2.经过鉴定筛选的18只HBsAg阳性的雄性HBV转基因小鼠,随机分为3组,中药灵猫方(LMF)组,恩替卡韦(ETV)对照组和空白对照组(CTRL),比较三组小鼠给药前后3个月血清HBV DNA、ALT水平及肝组织病理学的变化;建立表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的重组腺病毒感染模型,应用该模型研究灵猫方干预对TNFα诱导的JNK、MKK4和MKK7信号通路活化的影响。  结果:  1.构建了BCP区突变的HBV转基因小鼠模型:(1)血清学特点:HBV转基因小鼠血清中检测到HBsAg、HBeAg的表达,血清HBV DNA可达106IU/ml,血清ALT在200U/L水平波动。(2)组织病理学表现:①肝硬化、肝癌发生率:32-36周龄小鼠肝硬化发生率91.67%(11/12),肝癌发生率83.33%(10/12)。②HBV转基因小鼠有慢性肝炎表现,7-8周龄小鼠肝组织切片HE染色可见淋巴细胞浸润,12周龄及以上鼠龄小鼠肝组织可见肝组织可见包膜不完整,质地粗糙,肝脏大、小结节形成,并可见大小不一,单发或多发白色或肉色肝癌结节,肝组织切片HE染色可见假小叶的形成。③肝癌组织切片:HE染色见肿瘤组织与肝组织可见明显边界,胞核异形或消失,坏死区可见嗜伊红染色。天狼星红染色可见在肿瘤边界胶原着色和沉积,αSMA染色、CD34染色和Ki67染色见较多染色阳性细胞。④免疫组化 HBcAg染色见大片阳性染色区域。  2.(1)灵猫方干预对HBV转基因小鼠的肝硬化、肝癌发生率的影响:大体解剖可见LMF组小鼠有50%(3/6)的小鼠发生肝硬化,明显低于对照组(P<0.05),16%(1/6)的小鼠观察到肝脏表面有肝癌结节。对照组小鼠的肝脏100%(6/6)发生了肝硬化,66%(4/6)的小鼠可见明显的白色肝癌结节。ETV组小鼠有66%(4/6)的小鼠发生肝硬化,33%(2/6)的小鼠观察到肝脏表面有肝癌结节。(2)灵猫方干预对HBV转基因小鼠的血清HBV DNA水平的影响:LMF组小鼠3个月后的血清HBV DNA水平明显下降,P<0.05;对照组3个月前后血清HBV DNA水平无明显变化,P>0.05,ETV组3个月后血清HBV DNA水平明显下降,P<0.05。HBVDNA下降值灵猫方组与恩替卡韦和对照组相比较有统计学差异,P<0.05,但两组间比较无统计学差异,P>0.05。(3)对HBV转基因小鼠的外周血ALT水平的影响:LMF组干预3个月后血清ALT水平明显下降,P<0.05;对照组血清ALT水平前后比较无明显变化,P>0.05; ETV组3个月后血清HBVDNA水平下降,但P>0.05。ALT下降值灵猫方组与恩替卡韦和对照组相比较有统计学差异,P<0.05,但两组间比较无统计学差异,P>0.05。(4)灵猫方干预对HBV转基因小鼠的肝组织影响:与对照组相比,LMF组和ETV组小鼠肝组织HE染色可见肝小叶结构较完整,肝索排列整齐,肝细胞形状较规则。天狼星红染色胶原沉积面积明显少于对照组,P<0.01。  3.灵猫方干预重组腺病毒pAd-c149感染细胞模型:灵猫方处理前TNFα诱导的JNK和MKK4的磷酸化明显上调(P<0.01),MKK7的磷酸化明显被抑制(P<0.01);LMF处理后,TNFα诱导的JNK的磷酸化明显下调(P<0.01),MKK4的磷酸化无明显变化,MKK7的磷酸化上调(P<0.05)。  结论:  1.BCP区突变的HBV转基因小鼠有HBsAg和HBeAg的表达,HBVDNA高复制,并可稳定遗传给后代;小鼠肝组织HBcAg过表达;小鼠血清ALT水平显著升高,具有慢性肝炎的表现,能够形成肝硬化、肝癌。  2.灵猫方干预能够降低HBV转基因小鼠血清ALT和HBVDNA的水平,并可减轻小鼠肝组织的损伤,降低肝硬化的发生率。  3.灵猫方减轻肝细胞损伤,降低肝硬化发生率的作用与JNK和MKK7的磷酸化相关。
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