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第一部分Tim-3蛋白及相关炎症因子与大鼠脑出血的相关性研究目的:研究SD大鼠脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)后脑组织中Tim-3蛋白及相关炎症因子在ICH后不同时间点的变化,以及Tim-3蛋白主要表达细胞。方法:随机选择36只SD大鼠分为Sham组和ICH后12h、1d、3d、5d和7d共6组,每组6只。在相应的时间点处死所有的SD大鼠,取每组SD大鼠血肿周围0.15-0.2cm范围内脑组织,Sham组取对应区域脑组织,利用蛋白印迹技术检测该范围的脑组织Tim-3蛋白的表达。此外利用酶联免疫吸附试验检测该区域炎症因子IL-17和IL-11β表达水平。利用免疫荧光染色技术,检测Tim-3表达高峰时间点的Tim-3蛋白主要表达细胞。结果:1、血肿周围组织Western blot印迹实验表明,大鼠ICH后脑组织中的Tim-3蛋白表达先升高后下降,在ICH后不同时间点与Sham组比,1d组的Tim-3表达最为显著(P<0.001);2、大鼠脑组织酶联免疫吸附试验检测促炎因子IL-17和IL-1β表明,两种促炎因子与Tim-3蛋白在脑出血后表达变化相似;3、在Tim-3蛋白表达峰值时间点(1d),免疫荧光技术检测Tim-3蛋白在星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元中表达情况,结果显示Tim-3蛋白在小胶质细胞表达较星形胶质细胞和神经元显著(P<0.001)。结论:1、大鼠ICH后血肿周围组织Tim-3表达呈先上升后恢复,Tim-3蛋白表达在ICH后1d达表达峰值;2、相关促炎因子IL-17和IL-1β表达趋势类似于Tim-3在ICH后表达趋势;3、Tim-3蛋白在ICH后1d,主要表达于小胶质细胞,而非星形胶质细胞或神经元。第二部分 Tim-3蛋白表达上调和下调对大鼠脑出血后行为学及继发性脑损伤的影响目的:探索大鼠侧脑室注射人重组TIM-3蛋白(rhTIM-3)及Tim-3小干扰RNA(siTim3)对大鼠ICH后行为学及继发性脑损伤(secondary brain injury,SBI)的影响。方法:在大鼠实验中,任选144只,随机分配为假手术组(sham组)、脑出血+溶剂组(ICH+vehicle组)、脑出血+人重组TIM-3组(ICH+rhTIM-3组)、脑出血+非特异性小干扰RNA组(ICH+CtrsiRNA组)、脑出血+TIM-3小干扰RNA组(ICH+siTim3组),总计5组。于对应组侧脑室分别注射Vehicle、rhTIM-3、CtrsiNRA及siTim3进行干预。每组取6只大鼠组织进行Western Blot分析和ELISA测定;每组取12只大鼠进行行为学测试(其中Sham组为6只);分组取6只大鼠进行TUNEL染色、FLuoro-Jade B染色;每组取6只大鼠进行脑水肿评估。结果:1、Western Blot分析结果,rhTIM-3干预使得ICH后Tim-3表达上调(P<0.01),siTim3干预使得ICH后Tim-3表达下调(P<0.01);2、ELISA检测结果显示,rhTIM-3 干预使得 ICH 后 IL-1β(P<0.01)和 IL-17(P<0.05)表达上调,siTim3 干预使得ICH后IL-1β(P<0.05)和IL-17(P<0.05)表达下调;3、三天的短期行为学评分测试中,rhTIM-3干预后增加ICH后的行为学评分(P<0.05),而siTim3干预能够降低ICH后行为学评分(P<0.05);28天的长期行为学的Adhesive removal test和Foot-faulttest测试中也获得类似结果(P<0.05)。4、FJB染色试验中,ICH+Vehicle组的FJB阳性细胞较Sham组显著增多(P<0.05),rhTIM-3干预后较ICH+Vehicle组的FJB阳性细胞数目显著上调(P<0.05),而siTim3干预后较CtrsiRNA组阳性细胞数目减少(P<0.05)。5、TUNEL染色结果,ICH+Vehicle组较Sham组凋亡指数显著升高(P<0.05),ICH+rhTIM-3 组较 ICH+Vehicle 组凋亡指数显著升高(P<0.01),而 siTim3干预后较CtrsiRNA组凋亡指数降低(P<0.05)。6、脑水肿实验结果证实,rhTIM-3干预较ICH+Vehicle组加重ICH后脑组织水肿(P<0.05),而ICH+siTim3组较CtrsiRNA组脑水肿缓解(P<0.05)。结论:rhTIM-3加重ICH后神经行为学评分和ICH后SBI;而siTim3能够减轻ICH神经行为学评分同时缓解ICH后SBI。第三部分Tim-3信号通路对大鼠脑出血后继发性脑损伤影响的作用机制的实验研究目的:通过小胶质细胞M1、M2分型、促炎及抑炎因子检测及免疫共沉淀技术研究Tim-3信号通路对大鼠ICH后SBI潜在的作用机制。方法:1、通过免疫荧光染色实验分析rhTIM-3与siRNA干扰ICH后小胶质细胞M1(促炎态)、M2(抑炎态)型的转变情况。2、通过Western Blot检测方法,脑组织促炎因子和抑炎因子的表达情况。3、利用免疫共沉淀方法,检测干扰后Tim-3蛋白与Gal-9、TLR-4相互作用关系。4、体外免疫荧光染色,检测干扰后Tim-3蛋白与Gal-9、TLR-4相互作用关系。5、通过Western Blot实验,检测rhTIM-3与siRNA干扰后脑组织胞浆及胞核中HIF-1α表达情况。结果:1、ICH后M1、M2型小胶质细胞被激活(P<0.01),rhTIM-3干预促进小胶质细胞向M1型转化,阻止小胶质细胞向M2转化,siTim3干预则反之。2、脑出血后促炎因子、抑炎因子均被激活(P<0.01),rhTIM-3干预较ICH+Vehicle组促进促炎因子 iNOS、TNF-α、IL-1β激活(P<0.001),并抑制抑炎因子 arginase1、IL-4、IL-10表达(P<0.05);siTim3 干预较 ICH+Vehicle 组抑制促炎因子 iNOS、TNF-α、IL-1β激活(P<0.05),并促进抑炎因子 arginase1、IL-4、IL-10表达(P<0.01)。3、脑出血后 Tim-3蛋白与 Gal-9(P<0.01)、Gal-9 与 TLR-4(P<0.001)相互作用增强,rhTIM-3 加强 TIM-3蛋白与Gal-9相互作用关系(P<0.05),却削弱Gal-9与TLR-4相互作用关系(P<0.01)。4、体外小胶质细胞双标记荧光共染,进一步证实rhTIM-3加强Tim-3蛋白与Gal-9相互作用关系,却削弱Gal-9与TLR-4相互作用关系。5、ICH后胞浆及胞核的HIF-1α显著升高(P<0.01),rhTIM-3干预后,胞浆中HIF-1α显著下降(P<0.001),胞核中表达显著升高(P<0.001)。结论:人重组TIM-3干扰ICH后小胶质细胞向M1型转变,且促炎因子显著增加;siTim3干预后ICH后小胶质细胞向M2型转变,且抑炎因子显著增加。Tim-3蛋白通过竞争性结合Gal-9,促使TLR-4暴露,促进炎症反应。Tim-3在脑出血后作用机制与HIF-1α在胞浆及胞核的空间分布密切相关。