论文部分内容阅读
背景与目的:荨麻疹是皮肤、粘膜小血管扩张及渗透性增加出现的一种局限性水肿反应。临床上表现为风团、血管性水肿(AE)、瘙痒。风团每天发作或间歇发作,持续6周以上称为慢性荨麻疹。根据病程及发病原因将慢性荨麻疹分为慢性自发性荨麻疹(chronic spontaneous urticaria,CSU)与慢性诱导性荨麻疹。CSU是由已知或未知原因导致的病程大于6周的反复发作的风团,瘙痒伴或不伴有血管性水肿为特征的疾病。CSU人群发病率为0.5-1%且女性易发。尽管在任何年龄段均可发病,但常于20岁-40岁发病。大约15%的CSU患者病程长达5年以上。肥大细胞是CSU的主要效应细胞,其释放组胺,细胞因子及化学介质参与CSU发病机制。IgE与IgG自身抗体在CSU发病机制中起着重要作用。皮肤肥大细胞(MC)表面存在的抗IgE自身抗体及IgE高亲和力受体(FcεRI),其特点是能够直接引起肥大细胞脱粒;MCs与嗜碱性粒细胞可通过不同的刺激被激活,例如,通过抗原-特应性IgE(sIgE)及它与FcεRI相互作用。此外CSU被认为有自身免疫性背景,还因为不同的血清自身抗体的存在,例如抗甲状腺IgG自身抗体水平(抗甲状腺过氧化物酶抗体,TPO;抗甲状腺球蛋白抗体,TG)在CSU血清中升高,被认为参与了疾病的发病机制。虽然抗甲状腺IgG自身抗体不直接参与肥大细胞脱颗粒,但他们可能会增加其他使肥大细胞活化信号的易感性。由抗甲状腺IgG自身抗体引起的慢性炎症扰乱了甲状腺的正常结构,导致固存自身抗原的释放,从而诱发低度自身免疫反应。CSU与抗甲状腺IgG自身抗体水平之间存在密切的联系。而且,一项针对大量CSU患者的研究表明,与普通人群相比,CSU患者的一级亲属的荨麻疹发病率有所上升,并表明遗传因素起到了重要作用在CSU的易感性方面。近年来发现了一些组胺相关性基因与CSU存在关联,例如TGFβ1,CRTH2,C5AR1,ORAI1,CACNA1C。主要组织相容性复合体(MHC)基因在不同种族的CSU中被认为是候选标记。人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类及HLA Ⅱ类等位基因与CSU存在相关性。全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)的主要原理是从人类全基因组范围内的遗传变异即单核苷酸多态性SNP(500000-1000000个),筛选出与疾病性状关联的SNPs,再根据其在基因组中的位置和连锁不平衡关系推测可能的疾病易感基因,并对这些基因和疾病的关系进行验证及后续的功能研究。在过去的十年,一些复杂疾病的GWAS研究相继被报道,发现了大量关于生理和病理生理机制的新信息。如哮喘、特应性皮炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病。目前对CSU疾病活动及其对生活质量、治疗效果和疾病控制的影响的评估包括荨麻疹活动评分(Urticaria Activity Score,UAS)、血管性水肿活动评分(Angioedema Activity Score,AAS)、慢性荨麻疹生活质量(Chronic Urticaria Quality of Life,CU-Q2oL)、血管性水肿生活质量(Angioedema Quality of Life,AE-QoL)和荨麻疹控制试验(Urticaria Control Test,UCT)。这些评估工具都是主观的,追溯性的。MicroRNAs(miRNAs)是内源性非编码RNA分子,可降低靶向mRNA水平,并减少其同源靶蛋白的表达。他们可以通过许多不同的机制来实现这些影响,包括RNA降解、诱导去磷酸化、改变帽蛋白结合、减少核糖体占用率。由于分泌的miRNAs在体液中保持稳定,它们比活检更容易进行检测,侵入性更小。因此MiRNAs,无论是单独还是与其他已知的生物标志物结合使用,在许多研究中都被用作诊断工具。Th2介导的免疫通路通过IgE抗体的产生及其与FcεRI受体的结合诱导肥大细胞活化和脱颗粒。Th17细胞对肥大细胞产生抗体表现出抑制作用和刺激作用。最近的研究发现表明,Th2/Th17细胞因子、转录因子及Th2趋化因子分别在CSU患者的皮损、血浆和血清中被发现升高。因此,Th2和Th17途径可能参与CSU的发病机制。本研究第一部分采取两阶段GWAS,鉴别CSU的易感性位点及基因以增加对CSU遗传学病因的认识;第二部分研究miRNAs,CCL17及IL-17在CSU患者血清中的表达以找到可评估CSU严重程度及治疗反应的生物学标志物;第三部分完善补充有关中国汉族人群CSU与致敏性,血清总IgE(tIgE)及抗甲状腺IgG自身抗体的数据较少且不一致的缺陷。方法:第一部分,用 Illumina Omni ZhongHua-8 Human BeadChips 基因芯片检测443例活动期CSU患者及498例健康对照全基因组753603 SNPs分析。采用p值小于1e-6的标准,最终选择验证的位点是247个。用Fluidigm SNP基因分型在828例活动性CSU患者及1018例健康对照中对初筛数据中挑选247个与CSU有提示关联的SNPs进行基因分型(引物设计成功224个SNP),对其分型数据进行趋势卡方检验。第二部分:应用TaqMan MicroRNA Array检测20例活动性CSU患者及20例健康对照的血清miRNA表达谱的改变,并通过RT-PCR法对差异表达基因在59例活动性CSU患者及58例健康对照中进行了验证,同时用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测79例CSU患者及78例健康对照的血清CCL17及IL-17水平。第三部分:用详细的问卷调查记录1366例CSU患者人口统计学特征,临床特征及1424例健康对照人口统计学特征。并分别应用免疫印迹法,ELISA及化学发光法检测上述CSU患者及健康对照的过敏原sIgE,血清tIgE水平及anti-TPO及anti-TG抗体。结果:第一部分:通过主体成分分析(PCA)对443例CSU患者及498例健康对照在全基因组范围内的样本分型数据来检验病例和对照间的匹配情况,提示患者组及对照组样本匹配良好,不存在人群分层问题;初筛数据中挑选247个与CSU有提示关联的SNPs在828例CSU患者和1018例健康对照中进行基因分型,对其分型数据进行趋势卡方检验,发现其中2个SNPs在验证人群中显示与CSU有显著关联证据。包括rs72862937(RUNX2),P=1.33E-58,OR=2.57;rs1882(MICA),P=1.62E-08,OR=1.20。其余SNPs未发现与CSU有提示关联证据。第二部分:初筛实验MiR-125a-5p在CSU血清中的表达明显上调,miR-221-3p,miR-224-5p,miR-296-5p,miR-127-3p,miR-21-5p及miR-25-3p在CSU血清中表达明显下调。在59个患者及58个健康对照中扩大样本量进行qPCR验证,发现只有miR-125a-5p在患者血清中明显上调(P<0.0001)。59例CSU患者与58例健康对照相比,血清CCL17水平明显增加(P<0.0001)。血清IL-17在77例CSU患者及76例健康对照中均未测到,只有2例CSU患者及2例健康对照测到20 pg/mL左右的IL-17值。血清miR-125a-5p的表达与CCL17呈正相关(Spearman rho=0.394,p=0.002)。血清miR-125a-5p的表达在10例难治性CSU病例中明显高于49例非难治性CSU病例。血清miR-125a-5p及CCL17表达水平在疾病缓解期下降。第三部分:CSU患者平均年龄37.9岁(12-78岁),好发于女性(男女比例为1:2.06)。CSU患者首次发病平均年龄33.7岁。20-40岁为高发期。68.2%(n=932)的患者夜间发病。平均UASday评分为4.4±1.3。22.6%的患者合并血管性水肿。26.4%的CSU存在个人特应性疾病史及27.6%的患者存在家族性的荨麻疹/特应性疾病史。1366CSU患者中,1021例(74.7%)患者对至少一种过敏原敏感,1424例健康对照中有891例(62.6%)对至少一种过敏原敏感,两组之间存在明显统计学差异(P<0.0001)。过敏原在CSU患者中的致敏率与男性(P=0.02)及血清tIgE水平(P=0.002)相关。致敏率随着年龄增长而下降尤其是树木组合,艾蒿,螨虫及猫。CSU患者的血清tIgE水平明显高于健康对照的血清tIgE水平(P<0.0001)。CSU患者的血清总IgE水平与男性,CSU病史超过24月,合并AE,树木组合致敏,艾蒿致敏,螨虫致敏,蟑螂致敏,蛋清致敏,海洋鱼类组合致敏,虾致敏及螃蟹致敏相关。CSU患者中,18.2%的患者抗TPO抗体阳性,30.5%的患者抗TG抗体阳性,32.7%的患者抗甲状腺抗体阳性。健康对照中,13.3%抗TPO抗体阳性,21.4%抗TG抗体阳性,23.9%抗甲状腺抗体阳性。CSU患者及健康对照两组中抗TPO抗体阳性率(P=0.001),抗TG抗体阳性率(P<0.0001)及抗甲状腺抗体阳性率(P<0.0001)存在明显差异。CSU患者抗甲状腺抗体阳性率与患者高年龄,女性及血清低水平tIgE相关。结论:第一部分:本部分通过全基因组关联分析搜寻到中国汉族人群CSU2个易感位点rs72862937及rs1882。结合已发表的功能学研究,该区域内RUNX2及MICA基因可能为CSU的易感基因。第二部分:(1)MiR-125a-5p与CCL17在CSU患者血清中明显升高,且MiR-125a-5p在难治性荨麻疹患者中表达尤为上调。(2)miR-125a-5p与CCL17可作为CSU的血清生物标志物,可评估治疗反应。(3)miR-125a-5p与CCL17可能在CSU的发病机制中发挥协同作用。第三部分:(1)过敏原特异性IgE的致敏率,血清总IgE水平及抗甲状腺抗体的阳性率在CSU患者中明显高于健康对照;(2)在CSU患者中,过敏原的致敏率随着年龄增长而下降;(3)男性CSU患者比女性患者对过敏原更容易致敏;(4)在CSU患者中血清总IgE水平与男性,AE,CSU病程大于24月,树木组合致敏,艾蒿致敏,螨虫致敏,蟑螂致敏,蛋清致敏,海洋鱼类组合致敏,虾致敏及螃蟹致敏相关;(5)在CSU患者中抗甲状腺抗体的阳性率与年龄,性别及tIgE水平相关。