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从富含油脂的土壤中筛选到一株产耐高温酸性脂肪酶菌株B-36。对该菌进行了菌种鉴定、诱变选育、发酵条件优化、酶分离纯化及其酶学性质以及生产生物柴油研究。(1)产耐高温酸性脂肪酶菌株的分离筛选：从郑州西郊不同地点采集含油的土样50份。用溴甲酚紫平板筛选法分离到48株产脂肪酶菌株；对酶活力在9.0-9.6U/mL的16株菌进行酸性三丁酸甘油酯平板鉴定,得到一株产酶能力较强的菌株B-36。(2)菌株B-36分类鉴定：对菌株进行形态学、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析,确定该菌为克雷伯氏菌,命名为Klebsiella sp.B-36。(3)诱变选育：以Klebsiella sp.B-36菌株为出发菌株,经第一阶段8轮紫外线(UV)50s剂量诱变；第二阶段5轮微波25s剂量诱变；第三阶段8轮硫酸二乙酯(DES)15min剂量诱变后,选育得到一株稳定性好、酶活力较高的突变株DES-5,酶活力比原始菌株提高了77.5%。(4)产酶条件研究：通过单因素试验和正交设计L9(33)对Klebsiella sp.B-36菌株进行发酵培养基优化。研究表明,发酵培养基最优组合(%)：酵母膏0.8,蛋白胨3,橄榄油0.8；通过单因素试验和响应面设计对Klebsiella sp.B-36菌株进行发酵条件优化,得到最佳发酵条件为：pH4.85,温度46.5℃,装液量60mL/250mL,接种量2.12%,酶活力提高到21.79U/mL.(5)脂肪酶的分离纯化：发酵液离心,上清液分别经70%硫酸铵沉淀、透析除盐、Sephadex G-75层析等纯化后,用SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质纯度,得到电泳图谱为单一条带,分子量为27.19KDa,说明纯化得到较纯的蛋白质样品。脂肪酶纯化后比活力达到367.42U/mg.纯化倍数为10.29倍、回收率为26.45%。脂肪酶酶学性质研究表明：最适作用温度60℃、pH4.0,具有良好的热稳定性以及在酸性条件下稳定性较好。Mg2+、Ca2+、Na+对酶有明显的激活作用,Fe3+、Cu2+及Zn2+对酶有抑制作用,初步判定该酶是金属离子依赖酶。(6)对固定化脂肪酶Klebsiella sp.B-36催化生产生物柴油的工艺进行了研究。研究表明脂肪酶Klebsiella sp. B-36可以催化合成生物柴油。通过单因素试验,确定了酶法合成生物柴油的最佳工艺条件：固定化脂肪酶用量3g,反应温度40℃,反应时间24h,醇油摩尔比9：1(每隔8h加1/3甲醇总量,分3次流加),转化率最高可达到31.65%。总之,本文报道了克雷伯氏菌可以产耐高温酸性脂肪酶,并对其进行人工诱变、发酵条件优化、酶的分离纯化、酶学性质研究,酶法合成生物柴油的初步探索,具有较大的开发应用潜力。一系列基础研究为菌种改良和产脂肪酶的高效基因工程菌的构建奠定了基础。