【摘 要】
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几乎所有脊椎动物的基因组在发育起始时都没有转录活性,这说明早期发育过程完全依赖于母源因子,即卵子中储存的mRNA和蛋白质。母源因子的影响力还能持续到合子基因组激活后,与合子基因组表达的产物形成相互补偿。斑马鱼胚胎胚轴的形成、形态发生运动和原始生殖细胞的命运决定在很大程度上受控于母源因子,研究这些过程的分子机理有赖于母源突变体的获得。但是目前仍然缺少一种简单高效的母源产物敲除体系,这已经成为研究相关
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几乎所有脊椎动物的基因组在发育起始时都没有转录活性,这说明早期发育过程完全依赖于母源因子,即卵子中储存的mRNA和蛋白质。母源因子的影响力还能持续到合子基因组激活后,与合子基因组表达的产物形成相互补偿。斑马鱼胚胎胚轴的形成、形态发生运动和原始生殖细胞的命运决定在很大程度上受控于母源因子,研究这些过程的分子机理有赖于母源突变体的获得。但是目前仍然缺少一种简单高效的母源产物敲除体系,这已经成为研究相关基因功能的限制因素。本课题将斑马鱼密码子优化的Cas9（zcas9）连接到zpc启动子后,并通过To12转座系统构建了一种能够在卵母细胞中稳定高效表达Cas9蛋白的转基因品系:Tg（zpc:zcas9high）。通过与注射Cas9 mRNA或蛋白质比较,我们发现该转基因品系的编辑效率已经达到了进行常规基因敲除的要求。利用qPCR和Southern blot分析,我们证明该品系中zpc:zcas9结构是单拷贝插入的。利用inverse PCR进一步检测到其插入位点在gfra2a基因的第三个内含子中。插入片段并没有影响到gfra2a基因的表达,也没有影响到转基因鱼所产胚胎的数量、质量和存活率。为了验证该品系是否可以应用于母源基因敲除,我们构建了表达针对nanog的单个sgRNA表达载体,该载体同时带有GFP荧光筛选标记。通过I-SceI介导的转基因将sgRNA表达载体导入Tg（zpc:zcas9high）品系,并对带有GFP荧光的F1胚胎表型进行分析,我们发现有15.9%的胚胎下包严重缺陷,这与已报道的nanog母源突变体的表型是一致的。综上所述,我们成功构建了一种不但可用于常规基因编辑,也可用于母源基因敲除的转基因斑马鱼品系。相比于常规的Cas9 mRNA或蛋白注射,它显著简化了工作流程并降低了斑马鱼常规基因敲除的成本。我们也通过验证性的实验以一代鱼的时间成功获得了母源突变体。这些实验结果证明利用这种遗传学方法研究母源基因的功能具有高度的可行性。
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