研究背景:支气管哮喘（Bronchial asthma,以下简称哮喘）是机体对变应原刺激产生的以气道高反应性和慢性气道炎症为特征的变态反应性疾病。免疫耐受机制缺陷可能是哮喘发生的首要原因,Th1/Th2细胞失衡是关键环节。免疫耐受（Immunologic tolerance）是机体免疫系统在接触抗原性物质后产生的对该抗原的特异性免疫无应答状态。研究发现通过诱导机体的免疫耐受可防治对外来抗原反应和自身抗原过度激活的疾病,如移植排斥反应、肿瘤及过敏性疾病等。目前证实吲哚胺2,3双加氧酶（Indoleamine 2,3-dioxygense,IDO）介导的色氨酸代谢在外周免疫耐受起重要作用。IDO基因在转录水平的表达受到多种特异性炎性因子的刺激诱导,如α、β、γ-干扰素（Interferon-α、β、γ,IFN-α、β、γ）,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）等,IFN-γ是这类炎性因子的典型代表。同时为IDO的典型诱导剂,后者基因启动子区有前者结合位点分布,一旦二者结合,则刺激IDO在免疫系统关键细胞内表达,诸如DC细胞（树突状细胞）、单核-巨噬细胞（MNP）,从而诱导各种免疫调节功能。关于IFN-γ诱导IDO表达的途径受到多种促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、核转录因子-κ B（Nuclear factor kappa-B,NF-κ B）等调控。而这些促炎性细胞因子,受Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）信号转导通路下游产物调控;有研究表明IDO抑制剂1-甲基-色氨酸（1-methyl-tryptophan,1-MT）可以独立于IDO活性干扰树突细胞中的TLR信号传导,多项有关免疫调节机制的研究均提示IDO与TLRs家族在免疫相关性疾病中存在相性。然而,IDO与TLRs家族成员在支气管哮喘发病中的作用和其之间的相互关系尚无相关报道。TLRs作为模式识别受体在过敏性疾病发病中的作用已被广泛关注。近期有关实验发现,在自身免疫性疾病（AID）与过敏性疾病等的形成、进行中,TLR7的激活起着显著作用。近期对TLR7在过敏性疾病中的研究主要集中在过敏性鼻炎的发病机制和治疗方面,而过敏性鼻炎的主要致敏原是尘螨;目前WHO对于哮喘提出“同一气道、同一疾病”的概念,不仅提示临床医生要重视过敏性鼻炎的防治,也说明过敏性鼻炎与哮喘发病的紧密关联性。TLR7活化后生成的TNF-α、IFN-α 与IL-12这3类细胞因子会介导以Th1细胞为主的机体免疫反应,从而可纠正哮喘患者Th2细胞优势表现,下调IL-13与IL-4表达量,使得哮喘症状得到缓解。对小鼠哮喘模型,进行TLR7激动剂Imiquimod（咪喹莫特）的局部应用,发现肺泡m?（巨噬细胞）、TNF-α与B细胞下降,且IL-10与自然杀伤细胞（NK细胞）提高,如此可有效治疗哮喘小鼠。这也预示着以TLR7为靶点在哮喘的治疗中有着巨大的应用潜力。核转录因子κ B（transcription factor-κ B,NF-κ B）是TLRs的主要信号转导通路。NF-κ B与该通路相关因子如核转录因子-κ B抑制剂激酶（Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK α）和核转录因子-κ Bp65（Nuclear factor kappa-Bp65,NF-κ Bp65）,经由调节免疫同炎症介质、炎症相关因子间的级联放大（cascade）瀑布效应,对于免疫反应与炎症发挥枢纽作用。相关研究发现,在哮喘气道组织（含气道EC（上皮细胞）增生、平滑肌细胞（SMC）增生肥大、气道周围组织纤维化等）重建环节有NF-κ B激活现象发生。究其与TLRs的关联,TLRs可通过与其配体结合,可发生自身二聚体化,并与连接蛋白髓样分化蛋白88结合,进而激活NF-κ B,促进炎症因子、白细胞介素等合成与释放,进而诱导机体级联炎症反应。综上所述,对于IDO和TLR7-NF κ B通路之间在支气管哮喘发病过程中的作用机制以及两者在支气管哮喘发病中的关系的相关研究鲜见报道。鉴于此,本研究选择清洁级C57BL/6J小鼠用于实验,建立支气管哮喘小鼠模型并分离培养小鼠气道平滑肌细胞（ASMCS）,明确IDO和TLR7在哮喘小鼠气道上皮、平滑肌细胞等组织中的表达情况,以及干预IDO和TLR7在哮喘小鼠中的作用,并进一步探究IDO和TLR7-NF κ B通路在支气管哮喘小鼠发病的作用机制。本实验的主要目的是:1、检测TLR7在哮喘小鼠气道中的表达;预测TLR7表达及介导的NF-κ B信号通路在哮喘发病中的作用;2、检测IDO和TLR7表达干预对TLR7介导的NF-κ B信号通路相关因子表达水平,验证IDO和TLR7在哮喘发病中的作用和两者的关联性。3、进一步在分子水平上分析TLR7介导的NF-κ B信号通路在支气管哮喘发病过程中的作用机制。实验方法:（共有三部分实验）第一部分:支气管哮喘小鼠模型建立与观察及TLR7、IKKα和NF-κ Bp65表达检测。目的:检测IDO、TLR7在哮喘小鼠气道中的表达;预测TLR7介导的NF-κB信号通路在哮喘发病中的作用。方法:选择清洁级C57BL/6J小鼠用于实验,分为正常对照组与哮喘模型组,每组各10只小鼠。正常对照组不做任何造模处理。哮喘模型组用尘螨抗原提取物/氢氧化铝构建尘螨所致哮喘小鼠模型。所有实验小鼠均于末次激发后24 h内处死小鼠。进行气管肺泡灌洗液（BALF）抽取和冻存、进行细胞分类计数;肺泡灌洗结束后,取小鼠左肺支气管肺组织,用于苏木素-伊红（HE）及免疫组化检测。本章数据分析应用统计学专业软件（SPSS 21.0）进行统计学分析。结果:1、哮喘造模后各组小鼠行为学改变:对照组小鼠实验饲养期间体重、呼吸、毛色、活动、大小便等情况均无异常。而哮喘模型组小鼠表现出不同程度的呼吸急促、毛发竖直、弓背、抓耳挠腮、烦躁不安、大小便次数增多等症状,严重者呼吸减慢,行动迟缓,大小便失禁等表现。2、HE染色观察小鼠肺组织病理变化:正常对照组气道上皮平整、黏膜下无炎性细胞浸润、未见气道平滑肌增厚、未见炎性渗出物浸入。Asthma组肺内支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,炎性细胞和渗出物增多,粘液栓形成。3、免疫组化法检测小鼠肺组织中的TLR7、IKK α和NF-κ Bp65蛋白阳性表达率:正常对照组中TLR7呈强阳性染色强度;哮喘模型组中TLR7呈弱阳性染色强度。而哮喘模型组中IKK α和NF-κ Bp65呈强阳性染色强度。与正常对照组相比,哮喘模型组TLR7阳性表达率显著下降;IKK α和NF-κ Bp65阳性表达率显著上升（均P＜0.05）。4、支气管哮喘小鼠模型BALF中细胞计数及炎性因子水平检测:与正常对照组相比,哮喘模型组BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞百分比、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、巨噬细胞百分比显著升高（均P＜0.05）;且BALF上清液中IL-4和IL-10含量显著降低、IL-12和IFN-γ含量显著升高（P＜0.05）。结论:1、小鼠临床表现结合病理表现,提示用尘螨/氢氧化铝制作的哮喘小鼠模型造模成功;2、哮喘小鼠气道组织中,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞、IL-12和IFN-γ等炎症因子水平显著升高,提示哮喘发病过程中存在明显的炎症反应;3、哮喘小鼠气道组织中,TLR7低表达,而NF-κB信号通路中关键的两个因子:IKKα和NF-κBp65呈高表达,表示NF-κB信号通路激活;提示TLR7与NF-κB信号通路通过负向调节机制参与哮喘的炎症发病过程。第二部分:IDO与TLR7表达关联性以及干预IDO与TLR7对小鼠支气管哮喘的影响及潜在机制研究。目的:检测IDO和TLR7表达干预对TLR7介导的NF-κ B信号通路相关因子表达水平,验证IDO和TLR7在哮喘发病中的作用和两者的关联性。方法:选择清洁级C57BL/6J小鼠分为正常对照组,哮喘模型组,哮喘模型+1-MT组,哮喘模型+IFN-γ组,哮喘模型+TLR7激动剂组,TLR7基因敲除组,哮喘模型+TLR7基因敲除组。所有实验小鼠均于末次激发后24 h内处死小鼠,进行BALF抽取和冻存;肺泡灌洗结束后,取小鼠左肺支气管肺组织,进行HE染色及免疫组化检测。HE染色观察不同处理组小鼠肺组织病理变化。哮喘造模后不同处理组小鼠,分别用ELISA法检测BALF上清液中IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量;RT-PCR检测肺组织TLR7、IDO、IKK α和NF-κ Bp65的mRNA表达水平;Western Blot检测肺组织TLR7、IDO、p-IKK α和NF-κ Bp65的蛋白表达水平。本章数据分析应用统计学专业软件（SPSS 21.0）进行统计学分析。结果:1、IDO对支气管哮喘模型小鼠病理学特征、炎症反应和NF-κ B通路的影响:依据各实验结果发现,哮喘模型+1-MT组大量炎性细胞浸润,炎性水平升高（均P＜0.05）;TLR7和IDO mRNA和蛋白表达水平显著下降（均P＜0.05）;且p-IKKα和NF-κ Bp65蛋白表达水平显著增加（均P＜0.05）。而哮喘模型+IFN-γ组炎性细胞浸润及渗出物均减少,炎性水平降低（均P＜0.05）;TLR7和IDO mRNA和蛋白表达水平显著升高（均P＜0.05）;p-IKKα和NF-κ Bp65蛋白表达水平显著降低（均P＜0.05）。2、TLR7对支气管哮喘小鼠模型病理学特征、炎症反应、IDO表达和NF-κB通路的影响:依据各实验结果发现,TLR7基因敲除组气道上皮平整、黏膜下无炎性细胞浸润及纤毛脱落、未见气道平滑肌增厚、未见炎性渗出物浸入肺泡腔内;BALF上清液中IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量无明显变化（均P＞0.05）;TLR7和IDO mRNA表达水平及p-IKK α和NF-κ Bp65蛋白表达水平无明显变化（均P＞0.05）。哮喘模型模型+TLR7激动剂组炎性细胞浸润及渗出物均减少,炎性水平降低（均P＜0.05）;TLR7和IDO mRNA和蛋白表达水平显著升高,p-IKKα和NF-K Bp65蛋白表达水平显著增加（均P＜0.05）;哮喘模型+TLR7基因敲除组大量炎性细胞浸润炎性水平升高（均P＜0.05）;TLR7和IDO mRNA和蛋白表达水平显著下降,且p-IKK α和NF-κ Bp65蛋白表达水平显著降低（均P＜0.05）。结论:1、IDO抑制剂1-MT处理和TLR7基因敲除处理可诱导炎症反应,并激活NF-κB信号通路;IDO激动剂IFN-γ处理和TLR7激动剂处理可抑制炎症反应,并抑制NF-κ B信号通路激活;2、在哮喘的炎症反应过程中,IDO与TLR7的表达是同向的关联性;与NF-K B信号通路激活水平呈负相关;3、IDO和TLR7通过对NF-κ B信号通路的反向调节作用抑制哮喘炎症反应。第三部分:支气管哮喘小鼠气道平滑肌细胞中TLR7介导NF-κ B信号通路的作用机制研究。目的:进一步在分子水平上研究TLR7介导的NF-κ B信号通路在支气管哮喘发病过程中的作用机制。方法:选择清洁级C57BL/6J小鼠用于实验,分为正常对照组,哮喘模型组,哮喘模型+1-MT组,哮喘模型+IFN-γ组,哮喘模型+TLR7激动剂组,TLR7基因敲除组,哮喘模型+TLR7基因敲除组,处理成功后处死小鼠,无菌取其全部主气管。按要求进行气管平滑肌细胞（ASMCS）的培养和转染。RT-PCR检测ASMCS转染后TLR7的mRNA表达水平。Western Blot检测ASMCS转染后TLR7、p-IKK α和NF-κ Bp65的蛋白表达水平。MTT实验检测ASMCS转染后细胞增殖情况。Transwell实验检测ASMCS转染后细胞侵袭。流式细胞术分别检测转染后各组ASMCS转染后细胞周期与凋亡情况。本章数据分析应用统计学专业软件（SPSS 21.0）进行统计学分析。结果:1、RT-PCR检测ASMCS细胞转染后TLR7 mRNA表达水平:与正常对照组相比,其他各组TLR7 mRNA表达水平显著降低（均P＜0.05）。pcDNA-TLR7 NC组、siRNA-TLR7 NC组和pcDNA-TLR7+Asatone组相比无明显差异（P＞0.05）。与相应NC组相比,pcDNA-TLR7组TLR7 mRNA表达显著增加,而siRNA-TLR7组趋势相反（均P＜0.05）;Asatone组和Triptolide组TLR7 mRNA表达无明显变化（均P＞0.05）。且pcDNA-TLR7+Asatone组中TLR7 mRNA表达水平显著增加（均P＜0.05）。2、Western blot检测ASMCS细胞转染后TLR7、p-IKK α 和NF-κ Bp65 蛋白表达水平:与正常对照组相比,其他各组TLR7表达水平显著降低,各组p-IKK α和NF-κ Bp65 表达水平显著升高（均P＜0.05）。pcDNA-TLR7 NC组、siRNA-TLR7 NC组和pcDNA-TLR7+Asatone组相比无明显差异（P＞0.05）。与相应NC组相比,pcDNA-TLR7组TLR7表达显著增加,p-IKK α和NF-κ Bp65表达降低,而siRNA-TLR7组趋势相反（均P＜0.05）;Asatone组和TriptolideTLR7表达无明显变化（均P＞0.05）,前组p-IKK α和NF-K Bp65表达显著增加,后组表达显著降低（均P＜0.05）。且pcDNA-TLR7+Asatone组中TLR7 表达水平显著增加（P＜0.05）,而p-IKK α和NF-κ Bp65表达水平差异不明显（均P＞0.05）。3、MTT实验检测ASMCS细胞转染后细胞增殖情况:与正常对照组相比,其他各组增殖水平显著增加（均P＜0.05）。pcDNA-TLR7 NC组、siRNA-TLR7 NC组和pcDNA-TLR7+Asatone组相比无明显差异（P＞0.05）。与相应NC组相比,pcDNA-TLR7组和Triptolide组增殖水平降低;siRNA-TLR7组和Asatone组增殖水平升高（均P＜0.05）。且与pcDNA-TLR7 组相比,pcDNA-TLR7+Asatone组增殖水平升高（P＜0.05）。4、Transwell实验检测ASMCS细胞转染后细胞侵袭情况:与正常对照组相比,其他各组侵袭水平显著增加（均P＜0.05）。pcDNA-TLR7 NC组、siRNA-TLR7 NC组和pcDNA-TLR7+Asatone组相比无明显差异（P＞0.05）。与相应NC组相比,pcDNA-TLR7组和Triptolide组侵袭水平降低;siRNA-TLR7组和Asatone组侵袭水平升高（均P＜0.05）。且与pcDNA-TLR7 组相比,pcDNA-TLR7+Asatone组侵袭水平升高（P＜0.05）。5、流式细胞术检测ASMCS细胞转染后细胞凋亡和细胞周期分布情况:与Control组相比,其余组G0/G1期缩短（细胞比例减少）和G2+S期延长（细胞比例增加）,且细胞凋亡率呈显著下降趋势（均P＜0.05）。pcDNA-TLR7 NC组、siRNA-TLR7 NC组和pcDNA-TLR7+Asatone组相比无明显差异（P＞0.05）。与相应NC组相比,pcDNA-TLR7组和Triptolide组G0/G1期延长、G2+S期缩短,细胞凋亡率呈显著上升趋势（均P＜0.05）。而siRNA-TLR7组和Asatone组G0/G1期缩短、G2+S期延长,细胞凋亡率呈显著下降趋势（均P＜0.05）。同时,与pcDNA-TLR7 组相比,pcDNA-TLR7+Asatone组G0/G1 期缩短、G2+S期延长,细胞凋亡率呈显著下降趋势（均P＜0.05）。结论:1、对不同造模小鼠的气道平滑肌细胞的转染和刺激策略成功;2、上调TLR7表达可潜在抑制NF-κ B的信号转导通路的激活;3、上调TLR7表达、NF-κ B抑制剂处理可降低ASMCS增殖水平;4、从分子水平证实:上调TLR7表达和NF-κ B信号通路的抑制,可有效缓解哮喘平滑肌细胞等组织的增殖和重塑。