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[目 的]一型糖尿病(T1D)是由于自身免疫耐受失衡导致自身免疫细胞特异性攻击胰岛β细胞,导致糖代谢紊乱的自身免疫性疾病。目前尚无一种能有效治愈糖尿病的方法,因此寻找能预防或治愈T1D的新方法是必要的。本研究首先确定重组GAD65 L.lactis疫苗诱导表达条件,并具备免疫原性后,探究重组GAD65 L.lactis疫苗口服免疫的最佳时间及免疫程序。并设立对照组进行长期血糖及生存状况监测,评价重组GAD65 L.lactis疫苗对NOD小鼠的保护作用。在末次免疫后两周及NOD小鼠32周龄时检测肠道固有层淋巴细胞(Lamina propria lymphocytes,LPLs)及脾脏淋巴细胞群的耐受性细胞群,检测肠道菌群的组成以探究重组GAD65 L.lactis疫苗发挥保护作用的机制。[方 法]首先Western Bloting验证重组GAD65 L.lactis疫苗经不同浓度Nisin诱导表达GAD65蛋白是否正确表达。重组GAD65 L.lactis疫苗以1×109CFU/只的剂量经口服灌胃免疫8周龄的BALB/c小鼠和NOD小鼠,按连续免疫7天间隔两周后再连续免疫7天的免疫程序进行免疫。在末次免疫12小时后进行肠道菌群定植实验,取小鼠肠道内容物稀释并在含氯霉素的GM固体培养基上培养。在末次免疫两周后经ELISA实验检测免疫小鼠血清中GAD65特异性IgA和IgG抗体。用1 × 109CFU/只剂量的疫苗对4、8、12、16、20周龄的NOD小鼠以口服灌胃免疫,按连续免疫7天,间隔两周后再连续免疫7天的免疫程序进行免疫。每两周检测一次血糖及体重,至末次免疫后第20周,并收集免疫前以及末次免疫后第20周的NOD小鼠的粪便进行16S测序后分析。结合血糖、生存状况以及肠道菌群的稳定性来确定最佳免疫年龄。8年龄的NOD小鼠按相同的免疫程序及剂量进行口服灌胃免疫,末次免疫两周后用HE染色检测胰岛病理变化,每周测血糖、体重及观察生存率直至NOD小鼠32周龄。分别在末次免疫后两周和NOD小鼠32周龄时用流式细胞术分选NOD小鼠肠道LPLs及脾脏淋巴细胞CD8+T淋巴细胞、Treg细胞以及幼稚DCs细胞群。收集7、16、24、32周龄时NOD小鼠粪便进行16S测序后分析,评价重组GAD65 L.lactis疫苗对NOD小鼠肠道菌群的影响。[结 果]经鉴定50ng/mLNisin诱导的重组疫苗能分泌表达和胞质表达,但以胞质表达为主。重组疫苗能够诱导BALB/c小鼠和NOD小鼠产生GAD65特异性IgA和IgG抗体。末次免疫12小时后定植实验发现:重组疫苗在NOD小鼠肠道中定植能达到107CFU,而在BALB/c小鼠肠道中只能达到101CFU。4周龄组和8周龄组NOD小鼠在免疫完成后第10周出现高血糖,在第11周开始死亡,晚于其他年龄组出现高血糖及死亡的时间。与其他年龄组相比4周龄及8周龄组小鼠肠道菌群在免疫前及末次免疫后第20周其α多样性指数差异较小。在对8周龄的NOD小鼠免疫并监测血糖发现GAD65组发病率仅为16.6%,而空白66.6%、NZ9000组50%。末次免疫后两周,空白对照组已经出现胰岛坏死情况,但GAD65疫苗组胰腺仅表现为外周炎性细胞浸润。并且与对照组相比重组疫苗明显抑制肠道LPLs中GAD65特异性CD8+T细胞增殖(P<0.05),但在脾脏淋巴细胞中此抑制现象不明显(P>0.05);同时检测到GAD65疫苗组与其它对照组相比肠道LPLs中GAD65特异性CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞群、以及分泌IL-10的CD80+CD11C+的幼稚DC细胞群明显增多(P<0.05),DC的成熟明显被抑制,而在脾脏淋巴细胞中GAD65疫苗组的GAD65特异性Treg细胞群及分泌IL-10的幼稚DC细胞群比对照组增多但不显著(P>0.05),也无法抑制DC细胞的成熟。且GAD65疫苗组的小鼠血清TGF-β含量明显增多(P<0.05),但是血清IL-10含量没有差异(P>0.05)。在NOD小鼠32周龄时检测肠道LPLs及脾脏淋巴细胞中各细胞群发现:在肠道LPLs中重组疫苗对GAD65特异性CD8+T淋巴细胞无抑制作用(P>0.05),但能明显抑制脾脏淋巴细胞中CD8+T淋巴细胞增殖(P<0.05);在肠道LPLs以及脾脏淋巴细胞中,GAD65疫苗组的GAD65特异性Treg细胞群以及分泌IL-10的幼稚DC细胞群比其它对照组多,但不明显。同时各组血清中TGF-β以及IL-10含量无明显差别。7、16、24、32周龄收集到的NOD小鼠的粪便经16S测序分析发现重组GAD65 L.lactis疫苗对小鼠的肠道菌群稳定有促进作用。[结 论]50ng/mL浓度的Nisin能诱导重组GAD65 L.lactis疫苗胞质内表达和分泌表达GAD65蛋白,以胞质内表达为主。通过1 × 109CFU/只剂量的重组疫苗连续口服灌胃免疫7天,间隔两周再连续免疫7天能够诱导BABL/c小鼠和NOD小鼠产生GAD65特异性IgA和IgG抗体。免疫不同年龄的NOD小鼠发现,在小于12周龄进行疫苗免疫能更好的控制血糖,延长生命周期,维持肠道菌群稳定。在对8周龄的NOD小鼠进行口服灌胃免疫后发现,重组GAD65 L.lactis疫苗对NOD小鼠的保护效率高达83%,疫苗对NOD小鼠血糖的维持主要是通过缓解NOD小鼠胰腺炎的发生来实现的。疫苗主要通过诱导肠道GAD65特异性CD1 1c+耐受性DC细胞,进一步诱导Treg细胞分化,分泌TGF-β类细胞因子来抑制效应T细胞的增殖实现。同时重组GAD65 L.lactis疫苗能够通过调节NOD小鼠肠道菌群的平衡来增强疫苗保护效果。