结肠癌是胃肠道系统中最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的第三位。近年来,我国结肠癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势,且男性发病率要高于女性。然而,农村地区的结肠癌发病率和死亡率要明显高于城镇地区,这给我国带来了严重的公共卫生问题,因此积极开展结肠癌的预防和治疗研究具有重大的现实意义。飞龙掌血Toddalia asiatica Lam.为芸香科（Rutaceae）飞龙掌血属（Toddalia）植物,主要分布在我国五岭以南各地。飞龙掌血具有较好的药用价值,其全株可作草药,多用其根。民间多用于治疗各种痛症、跌打损伤、风湿性关节炎等。飞龙掌血的主要化学成分为香豆素类和生物碱类化合物。现代药理学研究表明,飞龙掌血的提取物及从其中分离得到的单体具有很多生物学活性,如抗氧化、抗炎症、抑菌、抗肿瘤等。因此,飞龙掌血具有良好的开发和应用价值。然而,目前有关飞龙掌血中的物质对结肠癌细胞作用的报道较少。于是本论文旨在筛选出飞龙掌血根抑制结肠癌细胞增殖的活性部位,并进一步研究其抑制结肠癌细胞增殖的作用机理。1.本文首先采用系统溶剂提取法对飞龙掌血根化学成分进行提取和分步萃取,分别得到正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯及水四个萃取部位,然后采用SRB比色法评价了各提取物对不同组织来源的癌细胞株的抑制增殖效果,结果发现二氯甲烷部位对人结肠癌HT-29细胞增殖抑制效果最好,因此飞龙掌血根二氯甲烷萃取部位的抗结肠癌作用具有进一步研究的价值。2.进一步考察二氯甲烷萃取物对HT-29细胞增殖和细胞周期的影响,首先发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物抑制细胞增殖具有浓度和时间依赖性;接着利用流式细胞术检测飞龙掌血根二氯甲烷萃取物作用HT-29细胞后细胞周期变化情况,发现HT-29细胞周期阻滞在G2/M期。这说明飞龙掌血根二氯甲烷萃取物抑制细胞增殖可能与细胞周期阻滞有关。3.p53蛋白在细胞周期进程中起着重要的作用。为了说明飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞周期阻滞是否与p53蛋白相关,我们利用p53野生型及p53突变型结肠癌细胞株来研究飞龙掌血根二氯甲烷萃取物对细胞增殖和细胞周期进程的影响,发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物能够抑制p53野生型及p53突变型结肠癌细胞增殖及使细胞周期阻滞在G2/M期。这说明飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞周期阻滞与p53无关。4.为了研究飞龙掌血根二氯甲烷萃取物抑制细胞增殖是否由细胞凋亡引起,我们采用AnnexinV/PI对其进行了双染色实验研究,结果显示飞龙掌血根二氯甲烷萃取物作用24小时可使HT-29细胞凋亡率显著升高,表现出促进细胞凋亡作用,并且具有剂量-效应关系。同时,我们运用Westem-blotting技术测定了飞龙掌血根二氯甲烷萃取物作用HT-29细胞之后细胞中caspase-3、caspase-8及caspase-9的激活情况,结果发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物处理可以激活caspase-3、caspase-8及caspase-9。这说明飞龙掌血根二氯甲烷萃取物可能是通过内部和外部途径诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡。5.细胞凋亡内部途径受Bax调控,为了研究Bax在飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞凋亡过程中是否起作用,我们使用Bax野生型及Bax突变型结肠癌细胞株来研究飞龙掌血根二氯甲烷萃取物对细胞凋亡影响,发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物能够诱导Bax野生型及Bax突变型结肠癌细胞凋亡,并且凋亡程度相当。这说明飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞凋亡与Bax无关。6.本研究还用H₂DCFH-DA荧光探针研究了飞龙掌血根二氯甲烷萃取物对HT-29细胞内活性氧水平的影响,结果发现,飞龙掌血根二氯甲烷萃取物作用之后可以显著提高HT-29细胞内活性氧的水平。有研究表明,活性氧可以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,为了研究飞龙掌血根二氯甲烷萃取物是否通过诱导细胞内活性氧的产生引起细胞凋亡和周期阻滞。本研究用抗氧化剂NAC预处理HT-29细胞,结果发现,飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞周期阻滞被部分阻断,而飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞凋亡没有变化。这说明飞龙掌血根二氯甲烷萃取物可能通过刺激细胞产生大量的活性氧,引起细胞周期阻滞。本课题发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物对人结肠癌HT-29细胞增殖有明显的抑制作用;飞龙掌血根二氯甲烷萃取物可能是通过细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡来发挥体外抑制HT-29细胞增殖。同时本研究发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导细胞周期阻滞与p53无关,以及诱导细胞凋亡与Bax无关。另外,本研究还发现飞龙掌血根二氯甲烷萃取物诱导HT-29细胞内活性氧的生成,活性氧的生成与细胞周期阻滞有关,而与细胞凋亡无关。总之,本研究为飞龙掌血的开发利用提供了理论基础,同时为抗结肠癌寻找了一种新的自然资源。