【摘 要】
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目的:本研究通过建立病毒性心肌炎（viral myocarditis,VM）小鼠模型,旨在阐明VM血清外泌体（VM-Exos）mi R-320对心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法:采用BALB/c小鼠由腹腔进行注射柯萨奇B组病毒（coxsackie virus B3,CVB3）,建立VM小鼠模型,等量PBS腹腔注射作为对照组;使用血清外泌体抽提试剂盒进行小鼠血清外泌体的提取,透射电镜观察血清外泌体
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目的:本研究通过建立病毒性心肌炎（viral myocarditis,VM）小鼠模型,旨在阐明VM血清外泌体（VM-Exos）mi R-320对心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法:采用BALB/c小鼠由腹腔进行注射柯萨奇B组病毒（coxsackie virus B3,CVB3）,建立VM小鼠模型,等量PBS腹腔注射作为对照组;使用血清外泌体抽提试剂盒进行小鼠血清外泌体的提取,透射电镜观察血清外泌体的形态、流式细胞术和纳米颗粒示踪分析检测血清外泌体粒径大小;将血清外泌体进行PKH26染色标记,与心肌细胞共培养,激光共聚焦显微镜显示心肌细胞摄取血清外泌体情况;使用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测CVB3感染前后心肌组织以及心肌细胞和内皮细胞的mi R-320成熟体和pri-mi R-320的表达变化;使用mi R-320 inhibitor转染VM-Exos处理的HL-1,并使用mi R-320 mimic转染HL-1,q RT-PCR检测mi R-320表达水平;运用流式细胞术检测HL-1细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹（western blot,WB）检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达水平;使用数据库在线预测mi R-320的潜在靶基因并取三个数据库的交集,运用生物信息学对所预测的潜在靶基因进行GO和KEGG富集分析;荧光素酶报告基因检测mi R-320与磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚单位1（phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 1,Pik3r1）的相互作用关系,将mi R-320与Pik3r1共同过表达,检测HL-1凋亡水平和凋亡相关蛋白的表达水平;WB检测过表达mi R-320后心肌细胞中AKT/m TOR通路蛋白磷酸化的变化。结果:血清外泌体的形态以及粒径大小符合国内外文献的报道;对照组和VM组的血清外泌体均能被HL-1摄取;与对照组相比,VM-Exos显著促进HL-1细胞凋亡,WB结果提示Bax表达水平上调,Bcl-2表达水平降低;q RT-PCR结果表明,与对照组相比,VM小鼠心肌组织中mi R-320显著上调,且mi R-320成熟体和pri-mi R-320在心肌细胞中均明显上调,而在内皮细胞中,仅存在mi R-320成熟体的上调,pri-mi R-320无明显变化;将VM-Exos与HL-1共培养后,HL-1细胞mi R-320水平显著上调,转染mi R-320 inhibitor后,与mi R-NC inhibitor组相比,q RT-PCR结果表明抵消了VM-Exos引起的mi R-320过表达,流式细胞术表明其凋亡率降低,WB结果为Bax表达水平降低,Bcl-2表达水平上调;转染mi R-320 mimic后,与对照组相比,q RT-PCR结果显示mi R-320表达显著上调,流式细胞术结果显示凋亡率显著升高;在线数据库预测交集到mi R-320的靶基因显示有78个;GO富集分析显示这78个mi R-320的潜在靶基因涉及细胞-基质粘附的调控、m RNA代谢过程和肌细胞凋亡过程的调控等生物学过程;KEGG富集分析提示mi R-320的潜在靶基因参与Ras信号通路、Fox O信号通路和m TOR信号通路等;过表达HL-1细胞中的mi R-320,与NC组相比,q RT-PCR结果显示Pik3r1 m RNA的表达水平显著下调,WB结果显示Pik3r1蛋白水平下调;通过荧光素酶报告基因检测,与NC mimic组相比,mi R-320 mimic显著抑制野生型Pik3r1-WT的荧光素酶活性,而对Pik3r1-MUT荧光素酶活性无明显影响;Rescue实验表明,过表达mi R-320上调HL-1凋亡率,同时上调Bax水平和下调Bcl-2水平,而同时过表达mi R-320和Pik3r1则逆转mi R-320上调导致的HL-1凋亡,同时Bax水平下调和Bcl-2水平上调;WB结果提示过表达mi R-320下调p-AKT和p-m TOR表达水平,而AKT和m TOR无明显变化。结论:VM-Exos mi R-320通过靶向Pik3r1并抑制AKT/m TOR通路调节心肌细胞凋亡并在VM发生发展中发挥重要作用。
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目的:1.探究LINC02381/let-7i-5p/KIFC1轴在乳腺癌进展中的分子机制;2.探究let-7i-5p在LINC02381/let-7i-5p/KIFC1轴中发挥的作用;3.分析KIFC1在乳腺癌患者外周血中的水平及和临床资料的相关性。方法:1.通过Star Base v3.0预测发现与let-7i-5p有潜在结合位点的lnc RNA;2.采用荧光素酶报告实验检测LINC02381
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