实验目的女性长期服食非甾体类抗炎药物,会造成排卵功能障碍。这暗示了过度抑制卵巢炎症信号,可能会损害卵巢卵泡发育的正常调控机制。NF-κB作为经典的炎症信号通路,它参与一系列细胞内正常或非正常的生理途径。然而,NF-κB在哺乳动物卵泡发育中的生理作用,仍然是不清楚的。因此,本文将主要探索NF-κB信号对卵泡发育的影响。实验方法本文利用了knock-in转基因技术,定点突变了NF-κB亚基p50上的一个保守半胱氨酸,使其突变为丝氨酸,从而大大增强了NF-κB核因子的DNA连接活性,建立了NF-κB激活小鼠模型。收取正常组和转基因组的小鼠卵巢,分析卵巢表型差异。后进一步进行石蜡切片,并通过形态学染色、免疫荧光、Q-PCR和Western-blot等方法,全面分析各级卵泡的差异,并检测与卵巢细胞增殖、凋亡和分化密切相关的各个重要因子的表达水平。在体外实验中,我们分别往COV434颗粒细胞株中加入了不同浓度的LPS和Bay11-7082(NF-κB抑制剂),对NF-κB信号进行不同的干扰,并检测颗粒细胞的增殖、凋亡与分化的水平。实验结果结果显示,当激活小鼠NF-κB内源性信号后,转基因组小鼠卵巢的重量与二维面积较正常组无明显差异,但卵巢表面出现了较多的血管分布。各级卵泡数目统计发现,转基因组的有腔卵泡数目增多,次级卵泡数目减少,并且与有腔卵泡发育密切相关的类固醇合成酶相关基因Cyp11a1、Cyp19a1的表达均出现上调。此外,在转基因组颗粒细胞中与分化密切相关的FSHR和LHR的表达较正常组均出现明显上调。与细胞增殖相关的Ki67和PCNA的表达也都出现了上调趋势。然而,在转基因组中,我们发现了闭锁卵泡数目与正常组相比明显减少,并且细胞凋亡相关因子如Fas、Fasl和c-caspase3的表达均有不同程度的减弱。在体外实验中,经LPS处理COV434的激活组的增殖水平提升,凋亡信号受到抑制,且与颗粒细胞后期分化密切相关的FSHR的表达也出现了上调。反之,经Bay11-7082处理后的NF-κB抑制组,其颗粒细胞增殖受到抑制,凋亡信号增强,FSHR的表达也受到了明显的抑制。实验结论综上结论,NF-κB信号很可能参与了正常的卵泡发育调控,其主要作用于次级卵泡向有腔卵泡转化的阶段。激活NF-κB内源性信号,能促进卵巢颗粒细胞的增殖与分化,抑制其细胞凋亡,从而加快次级卵泡向有腔卵泡的转化和抑制卵泡的闭锁。这个过程很可能由与促进了FSHR的表达,并抑制了Fas/Fasl的上游凋亡途径有关。