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背景:细胞自噬(Autophagy)广泛发生于真核细胞中,是进化保守的自我保护、维持细胞内环境稳态的机制,是细胞死亡的一种重要方式。自噬发生时,通过内凹的膜结构不断延伸,形成内吞小体,内吞小体包裹衰老的细胞器及待分解的物质形成自噬小体,自噬小体不断成熟到达溶酶体,与溶酶体结合形成自噬溶酶体,在酸性溶酶体酶的作用下,降解自噬溶酶体内包裹的物质,使其分解代谢并循环利用,实现细胞内环境的稳态和细胞器的更新。在酵母菌中发现的一系列自噬相关基因(Autophagy associated gene,ATG)可以调控细胞自噬,目前已发现三十多个ATG基因参与自噬过程。微管相关蛋白1轻链3-β(Microtubules associated protein 1light chain 3-β,LC3)是哺乳动物中与酵母ATG8同源的基因,自噬发生时,LC3转变为脂型LC3ΙΙ,蛋白水平检测LC3ΙΙ的增多和LC3ΙΙ在自噬体的膜定位,可作为自噬发生的标志。自噬晚期,自噬小体成熟形成自噬溶酶体,降解胞内物质,自噬底物蛋白p62(SQSTM1)的降解,可以用来检测自噬流的发生。细胞自噬的过程主要受m TOR(mammalian target of rapamycin)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3Ks)信号通路的调控。通过抑制m TOR和Ι型PI3K通路可以活化细胞自噬,而ΙΙΙ型PI3K信号通路与Ι型PI3K信号通路作用相反,活化ΙΙΙ型PI3K可以促进自噬的发生。同时AMPK、p53、Bcl2等信号分子也参与细胞自噬的调控。细胞自噬是生物体最基本的生物学现象,影响生物体生长发育等多个过程。细胞自噬的异常与肿瘤的发生发展相关。根据肿瘤类型、发展阶段的不同以及肿瘤细胞生长环境的不同,自噬在肿瘤的发生发展过程中起不同的作用,既可以促进肿瘤细胞的生长,也可以通过自噬抑制肿瘤的恶性扩增。基于自噬在肿瘤中作用的两面性,可以把自噬作为肿瘤治疗的一个新的靶点。Spred(Sprouty-related proteins with an EVH1 domain)蛋白家族是近年来发现的一类与Sprouty相关的膜蛋白。哺乳动物中包括Spred1、Spred2、Spred3三个家族成员。Spred蛋白通常含有3个结构域:EVH1(N-terminal Enabled/VASP homology 1 domain),KBD(central c-Kit binding domain)和SPR(C-terminal Sprouty-related domain)。研究表明Spred蛋白家族负调控ERK/MAPK信号转导通路,影响细胞的生长发育、增殖,血管淋巴管的生成,骨骼的形成和组织的运动能力等,并与肿瘤的发生发展、迁移侵袭有着密切的联系。Spred2是一个肿瘤抑制蛋白,抑制肿瘤细胞的增殖与分化。在一些肿瘤组织中,Spred1、Spred2均较正常组织表达量低,并且Spred的表达下降可能是肿瘤形成与恶化的重要标志。对Spred2的研究可能为肿瘤治疗提供新的治疗策略与靶点,但目前Spred2抑制细胞增殖的机制尚不明确。本研究发现在肿瘤细胞中,过表达Spred2促进自噬体的形成,加快自噬溶酶体的成熟,进而引起肿瘤细胞发生自噬依赖性细胞死亡。本研究证实,在人宫颈癌He La细胞中,稳定敲低Spred2后,可以显著的抑制自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)诱导的自噬体成熟,重新过表达Spred2,可以回复该效应。我们进一步对Spred2引起肿瘤细胞自噬的分子机制进行了探讨。研究发现,Spred2通过其SPR结构域中的与LC3结合的基序LIR(LC3-interacting region)序列与LC3蛋白相互作用和细胞内共定位。LIR基序突变体显著减弱了Spred2调节的自噬体的成熟。此外,Spred2通过其SPR结构域与p62蛋白存在相互作用和细胞内的共定位。在人宫颈癌细胞He La细胞中,Spred2与p62和溶酶体的标志蛋白LAMP2存在三者的细胞内共定位,提示p62参与Spred2调节的促进自噬体的成熟。在证实了Spred2蛋白的分子作用机制基础上,我们进一步对Spred2蛋白引起的自噬是否与其介导的细胞死亡相关进行了研究。缺失Spred2的SPR结构域,或者将其LIR基序突变后,减弱了Spred2引起的肿瘤细胞死亡,表明LIR基序为Spred2促进肿瘤细胞死亡所必需。此外,自噬抑制剂氯喹(Choroquine,CQ)显著抑制了过表达Spred2引起的细胞死亡。而在人宫颈癌细胞He La和人肺癌细胞A549中,敲低自噬相关基因ATG5、LC3、p62,同样抑制了过表达Spred2引起的促进肿瘤死亡的效应。基于上述研究我们推断细胞自噬可能是Spred2蛋白促进肿瘤细胞死亡抑制肿瘤细胞增殖的一个新的机制。综上所述,本研究发现Spred2可以促进自噬体的成熟、自噬溶酶体的融合,引起肿瘤细胞自噬依赖性细胞死亡。方法:1.分子构建Spred2蛋白LIR基序的突变体2.细胞培养及转染3.腺病毒感染瞬时表达目的蛋白4.免疫共沉淀和体外GST-Pull-down检测蛋白的相互作用5.免疫荧光实验检测蛋白细胞内共定位6.细胞平板克隆形成、台盼蓝计数、流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡结果:1.过表达Spred2抑制肿瘤细胞的增殖2.Spred2与LC3、p62存在相互作用和细胞内定位3.Spred2参与自噬过程,并促进自噬体的成熟4.过表达Spred2引起肿瘤细胞自噬依赖性的细胞死亡结论:1.肿瘤抑制蛋白Spred2促进自噬体的成熟;2.肿瘤抑制蛋白Spred2通过促进自噬溶酶体的融合,参与自噬引起肿瘤细胞自噬依赖性的细胞死亡。