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前言:近几年来,人们发现很多内源性蛋白具有很强的神经保护作用,在AD等中枢神经系统疾病中的治疗具有广阔的前景。然而,这需要将药物分子运送至整个中枢神经系统才能发挥作用。血脑屏障(blood brain barrier,BBB)阻挡了大多数的药物分子进入脑内。只有400-500 Da的脂溶性小分子蛋白能够穿过BBB,大分子蛋白进入中枢神经系统则需要通过其他途径,例如受体介导的内吞作用。BBB中的脑内皮细胞上表达一些受体,如转铁蛋白受体、胰岛素2型受体、低密度脂蛋白受体(LDLR)等,因此我们通过设计BBB上特异性受体的配体来作为药物转运的载体,使其可以进入脑内发挥作用。目前已有研究报道,由于载脂蛋白B(ApoB)存在低密度脂蛋白靶向受体(LDLR)结合域的特点,人们利用这一特性,设计构建了慢病毒载体,融合表达的ApoB的重组蛋白能够穿过BBB,并能使动物中枢神经系统的酶活性相比对照组提高50%。在前期实验中,我们发现在正常条件下,Cystatin C通过上调人脑微血管内皮细胞(HBMEC)内SIRT1的表达而激活了ADAM10的转录,从而使得HBMEC分泌的sAPPα增多,进而抑制Aβ的产生。基于此,本实验拟利用ApoB作为靶向载体,构建慢病毒介导的过表达Cystatin C的重组质粒。探究ApoB是否可以介导Cystatin C进入血脑屏障影响APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积。研究方法:1.分子克隆构建三组慢病毒载体系统:PLV-ss-Cys C-V5-ApoB(实验组)、PLV-ss-Bace1 inhibitor-V5-ApoB(阳性对照组)、PLV-ss-V5-ApoB(阴性对照组),基因测序后包装得到慢病毒颗粒。2.将纯化好的慢病毒颗粒腹腔注射到APP/PS1小鼠体内,观察其感染后状态。3.检测重组蛋白ApoB-Cystatin C穿过血脑屏障情况以及对小鼠脑内Aβ沉积的影响。4.Western blot检测Cystatin C在正常条件下对N2a 695细胞中总APP蛋白及其分泌酶表达水平的影响。5.Western blot检测Cystatin C在氧化应激条件下对N2a 695细胞中β分泌酶的影响。结果:1.将包装纯化的慢病毒注射到小鼠体内,感染30天后可以观察到重组融合蛋白在APP/PS1小鼠脾脏、肝脏中有显著表达。2.重组蛋白ApoB-Cystatin C能够进入脑实质中,并在感染实验组PLV-ss-CysC-V5-ApoB的APP/PS1小鼠脑中可以检测到其分布于脑血管周围。3.在慢病毒感染30天后的APP/PS1小鼠小脑中,重组融合蛋白ApoB-Cystatin C相比于阴性对照组有显著表达。4.重组蛋白ApoB-Cystatin C在脑实质中与神经元内有共定位,与星形胶质细胞几乎没有共定位。5.检测注射慢病毒3个月后的9月龄APP/PS1小鼠脑实质内Aβ沉积情况,发现以阳性对照组比对,实验组PLV-ss-Cys C-V5-ApoB相比于阴性对照组PLV-ss-V5-ApoB,对Aβ沉积有抑制作用。6.正常条件下,Cystatin C对N2a 695细胞中总APP蛋白及其分泌酶表达水平没有显著影响。7.在氧化应激条件下,Cystatin C可以抑制N2a 695细胞中β分泌酶的表达。结论:1.观察到APP/PS1小鼠经过腹腔注射,慢病毒能够感染肝脏、脾脏并表达ApoB-Cystatin C重组融合蛋白,重组融合蛋白跨过血脑屏障在APP/PS1小鼠小脑内表达丰富。2.在APP/PS1小鼠脑内,发现ApoB-Cystatin C重组融合蛋白与神经元有共定位,并且可以减少脑内Aβ的沉积。3.在体外模拟AD氧化应激环境,观察到Cystatin C可以抑制N2a 695细胞内BACE1的表达。