H2S被普遍认为是第三类气体信号分子,在哺乳动物中调节着重要的生理活动。而在微生物中的功能研究则相对较少,且这些研究大多与硫氧化代谢相关,其是否还参与了微生物中其他生理活动还有待研究。活性硫烷硫是指在生理条件下能够氧化或还原生物分子的具有氧化还原活性的含硫分子,其中硫原子价态通常为0价或-1价。H2S和硫烷硫都是胞内的固有组分,二者功能相似,并可以通过多种酶促反应和氧化还原反应进行相互转化。因此,谁是真正的信号分子也是近些年的研究热点。目前越来越多的证据表明H2S只是作为信号前体在胞间传递,而硫烷硫才是H2S发挥信号功能的具体形式。课题组前期的结果表明硫烷硫能够通过调节MarR家族转录调控因子MexR和OspR,分别影响了 P.aeruginosa中的耐药性和色素分泌。然而,关于硫烷硫是否是真正的信号分子还需要进一步的证据来证明,硫烷硫是否对MarR家族蛋白具有普遍的调控作用,进而影响更多的生理活动也值得深入探究。本论文分别以MarR家族的三种转录调控因子,E.coli中的MarR、S.aureus中的MgrA和P.aeruginosa中的OhrR,为对象探究硫烷硫作为信号分子对MarR家族转录调控因子的普遍调节作用,并揭示其调节的分子机制。通过EMSA实验,发现硫烷硫能分别降低MarR、MgrA和OhrR与DNA的亲和力,表明这3种转录调控因子在体外都可感应硫烷硫。通过对这3种转录调控因子上的半胱氨酸残基进行突变,发现仅保留80位Cys的突变蛋白MarR-5XS仍能感应硫烷硫,表明Cys80在该过程中起关键作用。对于MgrA,发现突变蛋白MgrA-C12S与DNA的亲和力不再受硫烷硫影响,表明Cys12对于MgrA感应硫烷硫至关重要。而对于OhrR,发现单半胱氨酸突变蛋白OhrR-C9S、OhrR-C19S和OhrR-C121S都能感应硫烷硫,但双半胱氨酸突变蛋白OhrR-C9SC19S、OhrR-C9SC121S和OhrR-C19SC121S均不再感应硫烷硫,表明这3个半胱氨酸均参与了 OhrR对硫烷硫的感应。与体外实验一致,通过构建荧光报告系统,发现MarR、MgrA和OhrR均能响应硫烷硫,导致荧光水平浓度依赖性上升,表明这3种转录调控因子在体内也都能感应硫烷硫。进一步地,对MarR和MgrA的关键半胱氨酸残基进行突变。对于MarR,发现相较于野生株,Cys80的突变使硫烷硫诱导的荧光水平显著降低,再次证明了 Cys80对于MarR感应硫烷硫至关重要。对于MgrA,发现Cys12的突变也导致硫烷硫诱导的荧光水平显著降低,强调了 Cys12在MgrA感应硫烷硫的过程中的关键作用。通过体积排阻液相色谱分析,发现硫烷硫处理会使MarR由二聚体形成四聚体及高倍多聚体;与之相似的,硫烷硫也会导致MgrA由二聚体形成四聚体。表明硫烷硫改变了 MarR和MgrA的构象。接着,通过液相色谱-质谱联用分析,在硫烷硫处理后的MarR中检测到Cys80之间二硫键及三硫键的形成;对于硫烷硫处理后的MgrA,检测到Cys12之间二硫键的形成,以及有对Cys12的过硫化和三硫化修饰;而在硫烷硫处理后的OhrR中,则在Cys9和Cys19、Cys9和Cys121、Cys19和Cys121之间都检测到二硫键的形成。通过同源建模分析,确定Cys9和Cys19之间更易形成分子内二硫键,而Cys9和Cys121、Cys19和Cys121之间更易形成分子间二硫键。利用非还原SDS-PAGE实验进一步探究,发现硫烷硫处理使MarR-5XS形成二聚体;类似的,硫烷硫也会使MgrA形成二聚体,但不能使MgrA-C12S形成二聚体;此外,硫烷硫也会使OhrR、OhrR-C9S和OhrR-C19S形成二聚体,但不能使OhrR-C121S形成二聚体。这些结果表明,MarR、MgrA和OhrR感应硫烷硫的机制都是利用半胱氨酸残基,引起构象改变,降低与DNA的亲和力,从而解除对下游基因的抑制,但具体机制略有不同。MarR感应硫烷硫有两种模式,一种是硫烷硫使两个MarR二聚体上的Cys80之间形成两组二硫键或三硫键,进而形成四聚体,该四聚体为失活状态;另一种则是使两个MarR二聚体上的Cys80之间形成单个二硫键或三硫键,进而形成四聚体,该四聚体则仍保有与DNA结合的能力。与之类似,硫烷硫也会使两个MgrA二聚体上的Cys12之间形成二硫键,不同的是,还会形成Cys12的过硫化和三硫化修饰。而对于OhrR,硫烷硫分别使Cys9和Cys121、Cys19和Cys121之间形成分子间二硫键,使Cys9和Cys19之间形成分子内二硫键。在已构建的体内荧光报告系统中表达已知可降解硫烷硫的关键酶——PDO,并检测相应菌株的生长情况和荧光水平。发现相较于这3个转录调控因子的野生型报告菌株,PDO的引入会导致整体荧光水平显著降低,表明这3个转录调控因子均能感应内源性硫烷硫。综上,本文确定了硫烷硫对MarR家族转录调控因子的普遍调控作用,揭示了硫烷硫调控的具体机制,这些结果为证明硫烷硫是真正的信号分子提供了新的证据;此外,还明确了硫烷硫可以调节与除硫代谢外其他生理活动相关的转录调控因子,这也为进一步证明硫烷硫调节其他重要生理活动提供了新的理论依据。