【摘 要】
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第二信使分子c-di-GMP和cGAMP能够刺激机体产生I型干扰素,具有潜在作为疫苗佐剂功能,因此c-di-GMP和cGAMP对家畜重大疫病的治疗具有潜在应用价值。为了研究VC0179的催化功能
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第二信使分子c-di-GMP和cGAMP能够刺激机体产生I型干扰素,具有潜在作为疫苗佐剂功能,因此c-di-GMP和cGAMP对家畜重大疫病的治疗具有潜在应用价值。为了研究VC0179的催化功能以及通过体外酶促反应合成产生c-di-GMP和cGAMP,需要建立一种简单、快速检测c-di-GMP和cGAMP的方法。迄今为止已经开发了一些体外检测c-di-GMP和cGAMP的方法,包括高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)、高效液相色谱(HPLC)、荧光共振能量转移(FRET)和薄层色谱分析(TLC)等。这些方法虽然已被证明有效,但是它们也存在一些缺点。RNA适配体是由一段脱氧核糖核酸或核糖核酸序列构成的对相应目标配体有高亲和力、高特异性稳定结合能力的具有特定复杂三维结构的单链核酸片段。最近,RNA适配体逐渐成为能够在体外和体内检测小分子的通用工具。为了检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP,本实验将VC2 GEMM-I核糖开关和它的突变体VC2/g20a连接到spinach2和t RNA支架上,开发出了一种基于RNA的核酸适配体。spinach2与spinach相比具有更高的热稳定性和折叠效率。构建得到的RNA适配体可以选择性地结合c-di-GMP和cGAMP,通过改变RNA适配体结合c-di-GMP和cGAMP的条件,得到了RNA适配体检测c-di-GMP和cGAMP的优化条件。在优化的检测条件下,RNA适配体与c-di-GMP和cGAMP的结合能力EC50分别为:89 n M和309 n M;VC2和VC2/g20a适配体对c-di-GMP和cGAMP的检测下限分别为5 n M和20 n M。并且发现RNA适配体特异性的结合c-di-GMP和cGAMP,进一步的实验发现转录后未纯化的RNA混合物能够显著的检测体外VC0179合成的c-di-GMP和cGAMP。因此本实验成功的构建了一种新的检测c-di-GMP和cGAMP的方法。本实验采用的RNA适配体检测c-di-GMP和cGAMP的方法是一种更加简单、快速的检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。这种简单、快速的的方法可用于检测其它类似的环二核苷酸合成酶活性,并且为在其他条件下检测c-di-GMP和cGAMP提供了可能。
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