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1、研究目的本研究主要是评价唑类抗真菌药物与苯丁酸联用对耐药念珠菌浮游菌、生物膜、及体内作用研究。2、研究方法2.1 PBA与唑类联用抗念珠菌浮游菌静态作用根据CLSI M27-A3测定真菌敏感性的方案,利用微量稀释法筛选对唑类药物耐药的念珠菌,并与苯丁酸联用对耐药念珠菌从静态作用进行研究,静态作用使用的菌液的工作浓度为2.5×10~3 CFU/mL,在35℃的条件下,恒温培养24 h。用XTT-甲萘醌方法,避光孵育2 h,用酶标仪测定在492 nm处OD值,利用分数抑菌浓度指数法(FICI)和生长率差值发(ΔE),评价药物联用抗念珠菌作用的效果。2.2 PBA与唑类联用抗耐药CA动态作用利用时间-杀菌曲线法进行评价,工作菌液浓度为5×10~3 CFU/mL,在35℃的条件下,恒温培养48 h。分别在0 h,12 h,18 h,24 h,36 h,48 h,取样,用XTT-甲萘醌方法,避光孵育2 h,用酶标仪在492 nm处测定OD值,绘制时间-杀菌曲线。2.3 PBA与FLC联用抗耐药CA生物膜作用2.3.1生物膜最小抑菌浓度的测定实验根据CLSI M27-A3测定真菌敏感性的方案,测定生物膜最小抑菌浓度。采用体外96孔板实验,研究PBA与FLC联用抗耐药CA生物膜作用。浓度为2.5×10~3CFU/mL的菌悬液,取200μL加入96孔板中,分别培养8 h和12 h,吸取菌悬液,PBS冲洗3次,加入PBA和FLC,在35℃的恒温培养中,培养24 h,用XTT-甲萘醌方法,避光孵育2 h,用酶标仪在492 nm处测定96孔板的OD值,然后利用分数抑菌浓度指数法(FICI)和生长率差值发(ΔE),评价药物联用抗耐药CA生物膜作用。2.3.2不同浓度的PBA与FLC联用抗CA生物膜作用研究制备浓度为2.5×10~3 CFU/mL菌悬液,培养12 h制备生物膜,除去菌悬液,用PBS冲洗3次,分别加入浓度为4μg/mL,32μg/mL,和128μg/mL的PBA和FLC溶液,培养24 h,采用结晶紫染色法进行在570 nm,测定OD值。2.3 PBA与FLC联用抗耐药CA的体内研究大蜡螟是实验室研究CA感染常用的体内模型。2.3.1 FLC最适浓度的筛选选取重量大约为0.25±0.2g大蜡螟,每组10只,FLC用二倍稀释法稀释到一系列的浓度640μg/mL-40μg/mL,每组注射4×10~6CFU的耐药CA菌液,感染2 h后,每组注射10μL的FLC溶液,连续观察4 d,确定大蜡螟生存率最高时,FLC浓度。2.3.2 DMSO对大蜡螟体内实验的影响PBA采用二倍稀释法稀释的浓度为1280μg/mL-40μg/mL工作浓度,每组10只体重相近(0.25±0.2g)大蜡螟,每只注射10μL PBA溶液,连续观察4 d,确定DMSO不影响实验的浓度。2.3.3 PBA体内的最适浓度的筛选FLC的浓度为320μg/mL,PBA浓度为320μg/mL-40μg/mL工作浓度,共4组,每组10只体重相近(0.25±0.2g)的大蜡螟,每只注射4×10~6CFU的CA菌液,感染2 h后,每只注射10μl的FLC与PBA混合药液,连续观察4 d大蜡螟的生存状态,确定生存率最高时,PBA的浓度。2.3.4 PBA与FLC联用,体内抗耐药CA作用FLC的浓度为320μg/mL,PBA的浓度为80μg/mL,每组16只体重相近(0.25±0.2g)的大蜡螟,共4组(对照组,FLC组,PBA组,FLC+PBA组)。每组注射4×10~6CFU CA菌液,感染2 h后,每组分别注射10μL的PBS,FLC,PBA,FLC和PBA的混合液,连续观察4 d大蜡螟的生存状态,绘制生存率曲线。2.3.5每组大蜡螟病理组织学变化研究从3.4.4试验中,在观察第2 d,每组取出2只大蜡螟,用包埋液包埋,用糖原糖原过碘酸雪夫染色液染色,用冰冻切片机切片,观察组织变化情况,并拍照。2.3.6组织载菌量培养研究从3.4.4试验中,每天每组取出3只大蜡螟,匀浆,接种到YPD固体培养基。恒温培养24 h。菌落计数用以测定每只大蜡螟菌落数(CFU/Larvae),绘制组织载菌量曲线。3、研究结果3.1 PBA与唑类联用抗念珠菌浮游菌作用静态作用研究显示PBA与唑类药物联用,对于非CA和敏感性的CA,呈现无关作用;对于耐药CA10,CA16呈现强协同抗真菌作用。当PBA浓度为32μg/mL时,使得FLC的MICs值从512μg/mL降低到1μg/mL;当PBA在32μg/mL时,能够使伊曲康唑的MICs值从8μg/mL降到0.125μg/mL;PBA在16μg/mL,能够使伏立康唑的MICs值从8μg/mL降低到0.25μg/mL。动态作用显示PBA浓度为32μg/mL时,与唑类药物联用,具有协同抗耐药CA作用,在12 h前,唑类的作用与两药联用的作用相近,但是抗菌效果都强于PBA单用和对照组;从24 h以后可以明显的显示出苯丁酸与唑类联用的抗菌作用是最强的,强于FLC单用组;而FLC单用组的抗真菌效果又强于PBA单用组及对照组。3.2 PBA与FLC联用抗耐药CA生物膜作用PBA与FLC联用时,对于耐药的CA10呈现强协同作用,对于8 h和12 h的生物膜实验,能够使PBA在32μg/mL时,使得FLC的SMICs值从大于512μg/mL降低到2μg/mL;对于耐药的CA16也呈现强协同作用,对于8 h和12 h的生物膜,能使PBA在32μg/mL时,使得FLC的SMICs值从大于512μg/mL降低到4μg/mL。FICI法评价耐药白色念珠菌生物膜的生物膜,FICI值为0.1289~0.1328,FICI值﹤0.5,PBA与FLC联用具有协同抗耐药CA生物膜的作用;ΔE模型的评价指标为ΣSYN与ΣANT的值,分别评价PBA与FLC联合抗耐药CA生物膜作用,分别测定联合用药对8 h和12 h的生物膜,测得的∑SYN值,分别为2122.77%和3253.34%;测得的ΣANT的值,分别为-21.73%和0%。各组的?E值为各组的∑SYN与∑ANT的和,可以计算出?E值远远大于200%,使得PBA与FLC联用抗耐药CA生物膜,具有强协同作用。固定FLC浓度,采用结晶紫染色法,结果表明随着PBA浓度的升高,PBA增强FLC的抗真菌作用越强。3.3 PBA与FLC联用抗大蜡螟体内耐药CA作用研究FLC单用用于治疗感染耐药CA的大蜡螟,大蜡螟生存率最高时,氟康唑的浓度为320μg/mL;DMSO浓度<5%时,用DMSO作为溶剂以大蜡螟为模型,DMSO对实验结果无影响;PBA单用时,大蜡螟生存率最高时,PBA的浓度为80μg/mL;FLC与PBA联用时,PBA能够显著增强FLC的抗耐药CA活性;大蜡螟病理组织学研究和组织清除率研究进一步证明了PBA能够显著增强FLC的抗耐药CA的活性。4、研究结论(1)苯丁酸与唑类药物联用具有协同抗耐药白色念珠菌浮游菌作用;(2)苯丁酸与氟康唑联用具有协同抗耐药白色念珠菌生物膜作用;(3)苯丁酸能够增强氟康唑的体内抗白色念珠菌作用。