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研究目的探讨富马酸替诺福韦酯(TDF,Tenofovir disoproxil fumarate)对体外培养小鼠胚胎前体成骨样细胞MC3T3-E1增殖、凋亡、细胞周期、钙结节形成及骨代谢相关因子表达的影响,初步探索TDF相关性骨代谢异常的机制。方法1.CCK8法检测TDF对MC3T3-E1细胞增殖的影响,体外培养MC3T3-E1细胞,分为空白对照组、DMSO处理组、TDF处理组,CCK8检测干扰24h和48h后细胞增殖情况;2.流式细胞技术和荧光染料ANNEXIN V/7AAD检测TDF对MC3T3-E1细胞凋亡的影响,体外培养MC3T3-E1细胞,分为空白对照组、DMSO处理组、TDF处理组,ANNEXIN V/7AAD染色后,BD-FACS Calibur流式仪检测24h和48h后细胞凋亡情况;3.流式细胞技术和荧光染料7AAD检测TDF对细胞DNA含量(细胞周期)的影响,体外培养MC3T3-E1细胞,分为空白对照组、DMSO处理组、TDF处理组,细胞固定7AAD染色后,BD-FACS Calibur流式仪检测24h后细胞周期的变化;4.实时定量荧光PCR(real-time PCR)检测TDF对MC3T3-E1细胞骨代谢相关因子转录水平的影响,体外培养MC3T3-E1细胞,分为DMSO对照组、TDF处理组,5天后提取细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测细胞骨代谢相关因子(runx2、rankl、opg)转录水平的变化;5.蛋白质印迹法(Western Blot)检测TDF对MC3T3-E1细胞骨代谢相关因子翻译水平的影响,体外培养MC3T3-E1细胞,分为DMSO对照组、TDF处理组,7天后提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞骨代谢相关因子(runx2、rankl、opg)翻译水平的变化;6.茜红素染色检测TDF对MC3T3-E1细胞钙结节形成的影响,体外培养MC3T3-E1细胞,分为NC组(普通培养液)、0nmol/L组(不含TDF的诱导培养液)、0.1‰DMSO组、3个TDF处理组(TDF浓度分别为50nmol/L、500 nmol/L、50000 nmol/L),21天后茜红素S染色检测细胞钙结节形成的变化。结果1.TDF对MC3T3-E1细胞增殖的影响:CCK8检测结果显示,与DMSO对照组相比,TDF干扰24h时,50nmol/L、500nmol/L、5000nmol/L浓度对MC3T3-E1细胞增殖无抑制,而48h时,50nmol/L、500nmol/L对MC3T3-E1细胞增殖无抑制。结果表明,不同浓度的TDF对MC3T3-E1细胞增殖抑制差异较大,而在临床血药浓度(约500nmol/L)下对细胞增殖无抑制。2.TDF对MC3T3-E1细胞凋亡的影响:根据TDF对细胞增殖抑制率结果,选择4个TDF浓度(50nmol/L、500nmol/L、5000nmol/L、50000nmol/L),干扰24h和48h,来检测对凋亡率的影响。研究结果显示,TDF对MC3T3-E1凋亡率均无影响。3.TDF对细胞DNA含量(细胞周期)的影响:选择4个TDF浓度(50nmol/L、500nmol/L、5000nmol/L、50000nmol/L),干扰24h,来检测TDF对细胞周期的影响。研究结果显示,500nmol/L、5000nmol/L对细胞周期无影响,TDF为50000nmol/L时,G2期细胞数增加,G1期细胞数减少,表明细胞周期G2期发生阻滞。4.TDF对MC3T3-E1细胞骨代谢相关因子转录水平的影响,骨代谢相关因子(runx2、rankl、opg)转录水平,TDF处理组比DMSO对照组水平下降。5.TDF对MC3T3-E1细胞骨代谢相关因子翻译水平的影响:TDF抑制细胞骨代谢相关因子(runx2、rankl、opg)翻译水平,TDF处理组比DMSO对照组水平下降。6.TDF对MC3T3-E1细胞钙结节形成:与对照组0.1‰DMSO相比,500nmol/L组钙结节明显减少,和50μmol/L组甚至无钙结节形成。结论1.不同干扰时间不同浓度的TDF对MC3T3-E1细胞增殖抑制差异较大,TDF浓度越高,干预时间越长,增殖抑制率越大,在临床血药浓度(约500nmol/L)下对细胞增殖无抑制;2.TDF对MC3T3-E1凋亡率均无影响;3.TDF浓度为50000nmol/L干扰24h,MC3T3-E1的细胞周期在G2期发生阻滞,而在临床血药浓度(约500nmol/L)下TDF对细胞周期无影响;4.TDF抑制成骨相关代谢因子runx2、rankl、opg的转录和翻译;5.TDF抑制MC3T3-E1细胞钙结节的形成;6.MC3T3-E1细胞在TDF的影响下,细胞钙结节形成受阻,runx2、rankl、opg等成骨相关代谢因子表达水平下降,可导致成骨功能受阻,为今后进一步研究TDF相关性骨量减少和骨质疏松的机制及临床治疗提供了研究基础。