论文部分内容阅读
背景:恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性脑肿瘤,很难用手术、放疗和化疗方法从根本上清除[20]。目前临床使用的化疗药物或放射治疗失效的主要原因是胶质瘤细胞产生抗凋亡作用[21],因此,亟需开发出新的化学药物通过非凋亡途径诱导神经胶质瘤细胞死亡。多聚(ADP-核糖)合成酶1(PARP-1)是参与DNA修复等多方面作用的核酶[22]。恶性胶质瘤PARP-1的基础水平明显高于正常神经细胞,其水平与胶质瘤的恶性程度及患者的低生存率呈正相关[7]。DNA断裂及修复信号均能激活PARP-1基因,而过量活性氧(ROS)或DNA烷化剂能引起DNA断裂[24]。轻度活化的PARP-1负责修复受损的DNA,这是脑胶质瘤细胞对化疗和放疗抵抗的一个重要因素。因此,PARP-1抑制剂能恢复或提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性[8-10]。矛盾的是,遗传研究表明PARP-1与PTC1蛋白共同抑制髓母细胞瘤(恶性胶质瘤的一个亚型)的发展[25]。此外,最近发现,PARP-1过度活化参与被化学化合物诱导肿瘤细胞死亡的新途径[4,5]。PARP-1在调节肿瘤细胞的生存或死亡方面具有双重功能蛋白,因此PARP-1依赖途径可能是未来胶质瘤治疗的一个潜在靶点。脱氧鬼臼毒素是一种抗癌活性成分,为传统的植物峨参木脂素的半合成物,植物峨参是欧洲西北部的一个常见的野生植物,存在于北美洲,非洲,亚洲和新西兰等地[11]。目前已经发现DPT具有多种生物学功能,如抗菌,抗炎和抗变态反应等[12],越来越多的证据表明,DPT具有良好的抗肿瘤活性,动物实验研究表明DPT能抑制胃癌和肺癌生长[13,14],体外的数据表明DPT可以诱导不同类型肿瘤细胞死亡如胶质瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌等[15-19]。DPT的抗肿瘤作用与微管失稳,线粒体相关的凋亡,血管生成和细胞周期G2/M期阻滞作用相关[11,16]。尽管据报道,DPT可以诱导U87和SF126胶质瘤细胞通过线粒体凋亡通路引起细胞死亡[12],目前还不清楚PARP-1基因是否与DPT诱导癌细胞死亡的关系。目的:采用大鼠C6胶质瘤细胞及人脑SHG-44胶质瘤细胞探讨DPT能否诱导PARP-1依赖的parthanatos死亡及探讨其发生机制。方法:1、通过MTT法和平板克隆形成实验检测DPT对胶质瘤细胞短时程和长时程抑制增殖和LDH释放试验检测其对肿瘤细胞的毒性作用。2、通过Western Blot法检测DPT诱导胶质瘤细胞PAR、PARP-1和AIF随药物作用时间梯度和浓度梯度蛋白表达变化。3、通过LDH释放法和Western Blotting法检测PARP-1抑制剂3AB预处理对DPT诱导的胶质瘤细胞杀伤作用及对PAR、AIF、PARP-1蛋白表达水平影响。4、通过si RNA沉默PARP-1基因检测PARP-1在DPT诱导的胶质瘤细胞杀伤中的作用及对相关基因表达影响。5、通过荧光显微镜观察和流式细胞术检测DPT诱导胶质瘤细胞线粒体膜电位(JC-1染色)变化及PARP-1抑制剂3AB预处理对线粒体膜电位的影响。6、通过单细胞琼脂糖凝胶电泳法(彗星实验)和DNA琼脂糖凝胶电泳检测DPT诱导胶质瘤细胞DNA损伤作用以及PARP-1抑制剂3AB预处理后相应变化。7、通过DCFH-DA探针装载观察DPT诱导胶质瘤细胞氧化应激反应及抗氧化剂NAC预处理对DPT诱导的胶质瘤细胞死亡率、ROS水平及相关蛋白的影响。结果:1、MTT法检测细胞增值率显示:DPT抑制C6和SHG-44细胞增殖活性在一定范围内呈现剂量和时间依赖性。平板克隆形成实验表明:低剂量DPT(5nmol/L)对C6和SHG-44胶质瘤细胞具有长时间抑制增殖作用。LDH法检测:DPT以剂量依赖的方式杀伤胶质瘤细胞系。2、Western blotting结果显示:随DPT作用浓度增加和作用时间的延长,PAR聚合物在C6或SHG-44胶质瘤细胞的胞浆内表达均剧增。同时,PARP-1和AIF蛋白水平在胞质和胞核内与DPT剂量和药物作用时间呈明显依赖性。3、PARP-1抑制剂3AB预处理后的DPT实验组胶质瘤细胞死亡率(LDH法)显著减少(p<0.01)。应用3AB预处理后,胶质瘤细胞胞质水平的PAR聚合物,胞浆和胞核内的PARP-1水平、核易位的AIF表达水平均显著降低。4、si RNA沉默脑胶质瘤细胞PARP-1基因后,无论C6还是SHG-44细胞,均能能降低DPT引起的肿瘤细胞死亡率(LDH法),通过western blot法检测相关蛋白表达发现,与单加DPT组相比,经过si RNA沉默PARP-1基因的DPT组,PAR、PARP-1、AIF蛋白表达均降低。5、荧光显微镜观察DPT处理后胶质瘤细胞的线粒体膜电位(JC-1染色)表明:随着DPT药物作用时间增长,线粒体膜电位持续下降(由红光逐渐转变为绿光)。通过流式细胞仪(JC-1染色)检测进一步证明:C6和SHG-44细胞随着延长DPT作用时间(12h和24h),线粒体膜电位逐渐下降,而应用PARP-1抑制剂3AB预处理后能够抑制DPT诱导的胶质瘤细胞线粒体膜电位下降。6、单细胞凝胶电泳(SCGE)结果显示:DPT处理C6或SHG-44组细胞有一个彗星的尾巴,但正常对照组细胞没有,并且彗星尾巴的平均长度与DPT的浓度和作用时间呈正相关。DNA琼脂糖凝胶电泳检测核酸片段显示:在C6细胞DPT180nmol/L和SHG-44细胞450nmol/L在12 h和24 h时,均观察到弥散带(DNA片段)。相比之下,用500u M/L浓度3AB预处理的DPT实验组则抑制由DPT引起的DNA片段。7、荧光显微镜观察DCFH-DA探针装载的DPT诱导C6和SHG-44胶质瘤细胞氧化应激反应结果显示:与对照组比较,药物作用12h后,C660n M、180n MDPT组和SHG-44150、450n M组胶质瘤细胞均呈现明亮的绿色荧光,而对应的NAC预处理的DPT组荧光强度均减弱。用荧光定量法检测DCFH-DA探针装载的DPT处理后胶质瘤细胞的ROS水平变化结果显示:ROS增加与DPT作用浓度梯度和时间梯度呈正相关,并且应用抗氧化剂NAC预处理后的DPT组ROS显著降低(p<0.05)。结论:1、DPT能够诱导胶质瘤细胞死亡,能够激活PARP-1依赖的parthanatos死亡。2、DPT诱导胶质瘤细胞发生parthanatos死亡是通过诱导PARP-1高表达实现的。3、PAR聚合物细胞质聚集,PARP-1过度表达、AIF的核易位、线粒体膜膜电位紊乱、DNA损伤和ROS过量均是DPT诱导胶质瘤细胞死亡的重要因素。