链霉菌是一类主要生活在土壤中的革兰氏阳性细菌,能产生丰富的次级代谢产物,在医疗、保健及生物防治等领域发挥着重要作用。链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)能够合成多种次级代谢产物,包括放线紫红素(actinorhodin,ACT)、十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin,RED)、钙依赖抗生素(the calcium-dependent antibiotic,CDA)、锌离子载体coelibactin和Ⅰ型PKS黄色色素(yellow pigmentedtypeIpolyketide,yCPK)。链霉菌中次级代谢产物的合成与生长周期密切相关,同时也受到多种因素的影响。链霉菌的生活史比较复杂,包括孢子、基生菌丝、气生菌丝三种形态:孢子萌发后形成多分枝的基生菌丝,基生菌丝向上生长产生气生菌丝,气生菌丝成熟后分化为孢子丝,最后断裂形成孢子。形成孢子是链霉菌在土壤中生活的主要繁殖方式,有助于其在资源丰富但不连续分布的土壤中寻找适宜的生存环境。细胞分裂是生命体生长和繁殖的基础,在几乎所有的细菌及大多数古生菌中,纤维蛋白同源蛋白FtsZ在这一过程中发挥着决定性作用,它在分裂点靠近细胞质膜的一侧聚集组装形成Z环并招募其它分裂元件形成分裂体,牵引细菌细胞膜发生内陷直至闭合,并指导细胞壁的合成。在链霉菌中至少存在两种形式的细胞分裂,即孢子分裂和菌丝体分裂,孢子分裂主要是通过SsgA相似蛋白(SALPs)SsgA和SsgB指导FtsZ招募至分裂点处形成Z环,并招募其它分裂原件形成分裂体,将孢子丝断裂成形态大小均一的单核孢子;在菌丝体分裂过程中,链霉菌不发生断裂,稀疏的Cross-wall将丝状菌体分隔成长短不一的多核隔室。FtsZ对于Cross-wall的形成也是必须的,但是它对FtsZ的依赖与孢子分裂不同,当FtsZ蛋白第249位的丙氨酸突变为苏氨酸后,Cross-wall能正常形成,但是孢子无法形成。在ftsZ的缺失菌株中存在一种被称为Cross-membrane的膜泡聚集结构,它在菌丝体中稀疏分布,将菌丝体分隔成长度不等的隔室,能代替Cross-wall行使部分功能。这种结构也存在于菌丝体生长的早期,参与菌丝体分裂的FtsZ和细胞壁成分分布在其中,推测可能与Cross-wall的形成有关。研究链霉菌的生长发育及细胞分裂过程有助于我们理解细胞分裂在多细胞细菌进化过程中发挥的作用,同时有助于细菌抗分裂药物的研发及其耐药性机制的研究。链霉菌次级代谢产物的合成及生长发育受到双组分信号转导系统(TCS)的调控。典型的TCS包括一个组氨酸激酶HK和一个应答调控蛋白RR。组氨酸激酶感受外界信号后会发生自身磷酸化,随后激活应答调控蛋白;激活的应答调控蛋白识别并激活或抑制下游靶基因的转录,调控基因的表达,以应对外界刺激。本研究主要对S.coelicolor M145中一对新的TCS-MacRS的生物学功能、作用机制及部分靶基因的功能进行深入研究。前期研究表明,S.coelicolor M145中调控蛋白编码基因.sco2120的转座子出入失火会影响次级代谢产物的合成。为了确定sco2120的功能,我们利用PCR-targeting技术分别敲除了sco212 及其上下游基因,根据各突变菌株的表型确定组氨酸激酶SC02121和应答调控蛋白SCO2120组成一对典型的双组分信号转导系统(TCS),而sco2118、sco2119及sco2122的功能与sco21260/2121双组分系统无明显联系。该TCS的敲除导致菌株次级代谢产物ACT、RED以及CDA产量显著下降,而气生菌丝产生提前。RNA-Seq结果分析表明,SCO2120/2121正调控ACT、RED及CDA合成基因簇的转录;正调控受锌离子特异调控蛋白Zur调控的基因集群,促进菌株Zn2+的代谢;正调控受氧化还原调控蛋白SoxR调控的基因集群;负调控受σu调控的基因集群并影响多个膜蛋白及脂蛋白基因的转录,是一个具有全局性调控功能的信号转导系统。因此,我们将该双组份系统命名为MacRS,表明其在膜蛋白(Membrane protein)的转录及在ACT及CDA合成调控方面的功能。为了研究MacR(SCO2120)的调控机制,我们在AmacR的基础上构建了表达MacR-Flag融合蛋白的菌株C-AmacR-Flag,该菌株在YBP培养基上生长时的表型与野生型菌株M145 个致,说明Flag标签的存在不影响融合蛋白中MacR的功能;Western blot分析表明MacR-Flag融合蛋白正常表达;ChIP-Seq和ChIP-qPCR分析结果表明,MacR在体内结合6个膜蛋白基因sco1700、sco4011、sco4225、sco4924、sco6728、sco7613,两个脂蛋白基因sco0607和sco7460以及一个类胡萝卜素脱氢酶基因scO2101的启动子区域;DNase I Footprinting分析表明,上述基因启动子中受MacR保护的区域均包含一个大小为16 bp的回文序列TGAGTACNNGTACTCA或其相似序列;EMSA分析表明MacR在体外能特异性结合这段16 bp回文序列,验证了 MacR识别序列的保守性和特异性;基因表达定量分析表明MacR调控上述靶基因的表达。利用Regpredict软件全基因组检索MacR结合的靶序列,在ACT合成基因簇中途径特异性调控基因actⅡ-orf4以及CDA合成基因簇中途径特异性调控基因cdaR的启动子区域均存在与MacR保守结合序列相似的序列,但是EMSA分析表明,在体外MacR不与包含该序列的DNA探针结合,说明MacR对ACT和CDA合成的影响可能不是通过直接调控途径特异调控基因实现的;另一方面,EMSA分析表明,MacR在体外与ZZn2+代谢相关基因sco7681、sco7682和sco0476启动子区域结合,由于Zn2+的代谢特异调控蛋白Zur的保守DNA结合位点与MacR比较相似,我们推测,MacR与Zur竞争调控上述基因的表达,共同调节菌体ZZn2+的代谢;而在soxR及SoxR靶基因、σU及σU靶基因启动子区域并没有发现与MacR保守结合序列相似的序列。有文献报道,调控蛋白SoxR的激活与ACT或其中间产物有关,anti-σU ResU含有ZZn2+结合结构域,因此,我们推测,MacR对SoxR靶基因的调控可能是通过ACT产量的变化间接实现的;而σU靶基因的调控则可能是由Zn2+浓度降低导致的。总之,MacR间接调控次级代谢产物的合成、SoxR及σU靶基因的转录;间接或直接调控ZZn2+的代谢。随后,我们对MacRS部分靶基因的功能进行了深入研究,发现至少三个MacR的靶基因与S.coelicolor细胞分裂相关,分别是mmpA(sco6728)、mmpB(sco4924)和mmpC(sco4011)。其中,MmpA和MmpC主要影响菌丝体隔膜形成,而MmpB在菌丝体分裂及孢子分裂过程中都发挥着重要作用。在菌丝体分裂过程中,FtsZ、Cross-membrane及细胞壁合成组分均被招募菌丝体分裂点,共同参与菌丝体隔膜的形成。荧光定位实验表明膜蛋白MmpA主要存在于菌丝体膜泡聚集结构中,包括Cross-membrane,mmpA基因缺失突变后,菌丝体分裂点处Z环FtsZ蛋白密度降低,Cross-membrane未被招募至细胞分裂点Z环附近,间隔细胞壁结构虽然在FtsZ的指导下形成,但是很多与细胞壁合成相关的组分在菌丝体内无序聚集,菌丝体隔膜形态滞留在Cross-membrane状态,Cross-wall的形成时间比野生型菌株晚,说明MmpA主要指导膜泡结构在Z环附近聚集,并与Z环形成后FtsZ的招募及细胞壁合成原料的运输和定位有关;MmpC在菌丝体分裂体的组装中同样发挥着重要作用,MmpC主要位于Cross-wall结构中,对菌丝体隔膜的形成有促进作用,mmpC基因缺失突变导致菌丝体分裂点处Z环FtsZ蛋白密度降低,菌丝体隔膜细胞壁形成延迟以及膜泡招募至Z环处发生障碍;MmpB可能和孢子分裂过程中的DynAB、SepG蛋白功能相似,在细胞分裂过程中将SsgB-FtsZ锚定在膜结构上,mmpB基因缺失后,菌丝体和前孢子中的Z环无法正常组装,导致细胞分裂发生异常,菌丝体的直径变粗,孢子形态发生异常。细菌双杂交试验结果表明,MmpA、MmpB和MmpC三者之间具有相互作用,并且都能与FtsZ招募蛋白SsgB相互作用,此外,MmpA与FtsZ分配蛋白CrgA也表现出相互作用。以上结果表明,Cross-wall中的膜组分很可能是由Cross-membrane结构融合而成,Z环及细胞壁的合成能加速这一过程,这也解释了Cross-wall中为什么存在孔道。MmpA和MmpC能直接参与菌丝体隔膜的形成,在Z环形成后FtsZ的招募,细胞间膜和细胞壁形成原材料的运输过程中发挥作用;MmpB能直接影响Z环的形成及稳定,对菌丝体隔膜的形成及孢子的正常分裂具有重要意义。综上所述,双组分转导系统MacRS具有全局性的调控作用,主要包括:(1)MacR直接调控膜蛋白基因如mmpA、mmpB及mmpC,影响细菌的菌丝体隔膜和孢子隔膜的形成,从而影响细胞分裂;(2)MacR间接调控次级代谢产物如ACT、RED及CDA合成基因簇的转录,影响次级代谢产物的合成;(3)由于MacR与Zur的保守DNA结合位点序列相近,可能竞争调控Zn2+代谢相关基因,影响Zn2+的代谢;(4)mac;基因的缺失导致菌株体内Zn2+浓度显著降低,间接引起σU靶基因的转录水平发生变化;(5)MacR可能通过对ACT合成的调控间接影响SoxR靶基因的转录。