【摘 要】
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研究背景万古霉素（vancomycin,Van）的使用已经有半个多世纪,它是治疗严重革兰氏阳性耐药球菌的首选药物,在住院感染病人中的使用比例高达35%。但是急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是万古霉素临床应用中不可忽视的严重副作用。Klotho是一种在正常肾小管上皮细胞中高度表达的跨膜蛋白,研究表明Klotho对多种肾脏疾病具有保护作用,但是Klotho在万古霉素诱导急性
【基金项目】
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国家自然科学基金（81703603）； 国家自然科学基金（82173897）；
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研究背景万古霉素（vancomycin,Van）的使用已经有半个多世纪,它是治疗严重革兰氏阳性耐药球菌的首选药物,在住院感染病人中的使用比例高达35%。但是急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是万古霉素临床应用中不可忽视的严重副作用。Klotho是一种在正常肾小管上皮细胞中高度表达的跨膜蛋白,研究表明Klotho对多种肾脏疾病具有保护作用,但是Klotho在万古霉素诱导急性肾损伤中的作用和潜在分子机制仍然未知。研究目的本研究旨在探索Klotho蛋白在万古霉素引起急性肾损伤（Van-AKI）中的作用机制,以及Klotho蛋白和靶向信号通路之间的调控关系,为Klotho治疗肾脏相关疾病的研究做补充,为临床预防和管理Van-AKI提供基础研究支撑。研究方法体外实验:培养人肾小管上皮细胞（human kidney tubular epithelial cells,HK-2）,给予万古霉素刺激24小时,探究万古霉素对Klotho表达水平的影响。提前孵育重组Klotho蛋白1小时,再加入万古霉素,使用逆转录-实时定量荧光聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测肾损伤标志物肾损伤分子1和中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白;使用流式细胞检测术,细胞免疫荧光测定细胞凋亡比例和活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的水平;使用蛋白免疫印迹法（western blot,WB）测定凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和C-caspase3,以及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase 3,GPx3）、JAK2和STAT3的表达;利用小干扰RNA技术降低细胞内源Klotho蛋白的表达量,和JAK2/STAT3抑制剂共培养,使用WB、RT-qPCR和细胞免疫荧光探索Klotho缺失对JAK2/STAT3/GPx3信号轴的调控作用。体内实验:构建Van-AKI动物模型,腹腔注射重组Klotho蛋白,使用分光光度法检测肾损伤标志物尿素氮和血肌酐、肾组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平;细胞免疫荧光测定细胞凋亡比例和ROS的水平;酶联免疫吸附法检测血浆中Klotho、氧化应激标志物8-羟基脱氧鸟苷和GPx3的表达水平;WB和RT-PCR检测细胞凋亡数量和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、C-caspase3和JAK2/STAT3/GPx3通路的表达水平。研究结果万古霉素给药24小时后,Klotho在HK-2中表达下调,表达趋势与万古霉素剂量之间存在依赖性;在小鼠肾组织和血浆中,Klotho的表达也显著降低。在体外,外源Klotho降低万古霉素处理后JAK2/STAT3通路的磷酸化表达,增加GPx3的表达,抑制ROS水平和凋亡细胞的比例,而沉默Klotho则表现出相反的情况。重要的是,JAK2/STAT3的特异性抑制剂AG490和S3I-201逆转了 Klotho siRNA引起的GPx3表达增加。在体内,相比于万古霉素给药组,重组Klotho治疗组小鼠的肾组织损伤和线粒体微观结构得到显著改善,JAK2/STAT3的磷酸化水平得到抑制,肾组织和血浆中的GPx3的表达水平显著增加,氧化损伤水平和细胞凋亡比例明显受到抑制。研究结论实验结果提示 Klotho siRNA 加重 Van-AKI,而 rKlotho 改善 Van-AKI。rKlotho 通过负调控JAK2/STAT3信号通路,增加抗氧化酶GPx3的表达,降低ROS在体内的蓄积,从而抑制氧化应激和减少细胞凋亡,实现对Van-AKI的逆转作用。
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