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随着老龄化的加剧,骨质疏松症患病率也在持续增加,由其引起的骨折不仅影响人们的生活质量也给人们带来了沉重的经济负担,被世界卫生组织(WHO)视为第二健康问题。目前,用于治疗骨质疏松的药物主要有二膦酸盐、雌激素替代疗法、选择性雌激素受体等。尽管这些抗骨质疏松药物能有效提高骨密度和减少骨折,但长期使用存在一定的副作用。因此,近年来越来越多的研究把注意力集中在天然产物上。目前对抗骨质疏松天然产物的研究主要集中在黄酮类物质如淫羊藿苷和大豆异黄酮等上。然而,随着研究发现酪蛋白磷酸肽可以增强佝偻病婴儿的维生素D依赖性骨钙化作用,越来越多的研究把目光转向生物活性肽方面,但大多研究集中在动物性胶原蛋白肽上,因此研究低致敏性的植物性来源的蛋白肽对骨质疏松的改善作用是必要的。微藻是一种小而普遍存在的生物,生长速度快、繁殖周期短、蛋白质含量高、致敏性低且可以在一些极端环境中生存,如极端盐度、极端光照、极端温度甚至营养不良,可能提供更多结构新颖、毒副作用小的生物活性物质。因此,本研究以四种微藻(包括蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、螺旋藻(Arthospira platensis)、拟球藻(Nannochloropsis oceanica)和杜氏盐藻(Dunaliella salina)为研究对象,分析这些微藻蛋白或蛋白肽的理化特性、功能特性、抗氧化活性、钙螯合能力及成骨活性,研究微藻蛋白肽对去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松的改善作用及通过联合肠道微生物组学和代谢组学深入阐明其作用机制,最后结合骨质疏松样斑马鱼和分子对接模型筛选具有潜在的改善骨质疏松活性的肽。获得的主要研究结果如下:(1)对这四种微藻的蛋白进行分离,获得蛋白核小球藻蛋白(CPP)、螺旋藻蛋白(APP)、拟球藻蛋白(NOP)和杜氏盐藻蛋白(DSP),并分析它们的理化特性和功能特性。理化特性结果显示NOP和DSP的平均分子量分布在91-341662道尔顿(Da)范围内,高于CPP和APP的99-151790 Da,然而,NOP和DSP的平均分子量主要集中在10 k Da左右;这四种微藻蛋白均具有蛋白质的紫外可见光谱(UV-Vis)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)特征,但在结构构象上、固有荧光和热稳定性上存在一定的差异,其中APP和DSP具有较高的热稳定性。功能特性分析显示CPP、APP和DSP比NOP具有较高的溶解度、起泡性、起泡稳定性和乳化稳定性等功能特性;这些微藻蛋白的功能特性受结构构象的影响外,还受p H环境的影响。(2)通过体外模拟胃肠道消化获得了蛋白核小球藻蛋白肽(CPPH)、拟球藻蛋白肽(NOPH)、螺旋藻蛋白肽(APPH)和杜氏盐藻蛋白肽(DSPH),并对这些微藻蛋白肽(MPHs)的理化特性、抗氧化活性、钙螯合能力和成骨活性做初步的分析比较。结果表明,这四种MPHs的平均分子量主要集中在0.5 k Da和5 k Da之间,且均含有40%以上的必需氨基酸,超过联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(FAO/WHO)对必需氨基酸推荐的最低要求;然而,DSPH含有较丰富的天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸;经消化后,这四种MPHs的UV-Vis和FTIR吸收光谱均发生了变化,可能是由于一些芳香族残基暴露于极性环境而引起蛋白质构象的改变;此外,DSPH表现出较高的钙螯合能力、抗氧化活性和成骨活性。(3)以1 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的低、中和高三个剂量的DSPH(DSPHL、DSPHM和DSPHH)对OVX大鼠进行灌胃,并以阿仑膦酸钠(ALE)作为阳性对照组研究DSPH对OVX大鼠骨质疏松的改善情况。结果表明,DSPHH可在一定程度上控制OVX大鼠体重的升高,而升高肝指数和(或)子宫指数。DSPHH的干预后,骨吸收标志物TRACP-5b从OVX组的0.88±0.22 U/L显著降低到0.66±0.06 U/L(P<0.05),骨形成标志物PINP从OVX组的1.20±0.37m IU/m L显著升高到1.52±0.51 m IU/m L(P<0.05),且该影响与ALE的主要抑制骨吸收标志物不同;然而,与ALE作用一致,DSPHH能改善因OVX造成的骨小梁稀疏和间隙变大等,主要体现为对骨密度(BMD)、骨矿物质含量(BMC)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(TB.N)、骨表面积(BS)和结构模型指数(SMI)等骨形态学参数的调节;此外,DSPHH可调节Wnt/β-catenin信号通路,但调节作用有限。(4)基于16S r DAN扩增子测序研究了DSPHH对OVX大鼠肠道菌群的影响。结果表明,DSPHH降低了厚壁杆菌(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的比例,还降低了变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度;共发现10种可能与DSPHH对骨质疏松改善作用有关的属水平上的特征菌群,这些菌群与免疫系统或炎症等有关,且对骨代谢存在不同程度的负调节作用;DSPH可能通过恢复肠道菌群的稳态和降低肠道通透性从而抑制肥胖、调节免疫系统和抑制炎症反应,最终调节骨代谢和起到对骨质疏松的改善作用。(5)基于UHPLC-MS/MS技术,利用非靶向代谢组学方法研究DSPHH对OVX大鼠血清代谢的影响。结果表明,OVX能显著改变大鼠的血清代谢,共显著引起了89种代谢物的代谢絮乱(P<0.05),而DSPHH的干预则能扭转14种代谢物恢复正常的代谢水平;DSPHH的作用与花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、脂质代谢、色氨酸代谢和谷胱甘肽代谢等代谢通路密切相关;14种特征代谢物中有5种代谢物与特征肠道菌群和骨形态学参数有着不同程度的相关性;因此,DSPH对骨质疏松的改善作用可能通过以下机制进行调节:一方面,DSPH可能通过调节因OVX引起的肠道菌群的混乱和降低肠道通透性,从而调节血清代谢、促进抗炎反应并提高免疫系统,最终抑制骨吸收和促进骨形成;另一方面,DSPH可能通过抑制脂质过氧化和增强谷胱甘肽抗氧化系统等减少氧化应激对骨质疏松的影响,从而促进骨形成。(6)通过超滤、阴离子交换色谱、骨质疏松样斑马鱼模型、分子对接模型及HPLC-MS/MS技术,从DSPH中纯化、筛选和鉴定出了一条能促进由地塞米松(Dex)诱导的骨质疏松样斑马鱼骨形成的肽,其序列为ALVFQAQH(P32)。P32对骨质疏松的改善作用可能与其理化特性有关,如序列、氨基酸组成、分子量和疏水性等。此外,该肽可能通过调节成骨细胞特异性基因(Runx 2α)和抗氧化相关基因(Cu-Zn/SOD和CAT)的m RNA表达促进骨质疏松样斑马鱼的骨形成。