论文部分内容阅读
慢性支气管炎（chronicbronchitis，CB）是一种常见的以咳嗽、咳痰伴喘息为特征的慢性呼吸道炎性疾病。根据《四部医典》记载，慢性支气管炎属于藏医传统理论中“罗乃提波（(D·JJ·EE·EJ)）、培根型肺病（(DC·J·l)）”的范畴，意为气管、支气管部位培根偏盛，培根黏液骤增，淤积或堵塞气道，诱发咳嗽、咳痰、喘息的疾病。藏医学认为隆、赤巴、培根是构成人体进行生命活动的三种能量与物质基础，也是诱发各类疾病的三大基本因素，即为藏医学的三因学说理论。由于反常的季节时令、饮食、起居等因素打破了三因的动态平衡，引起隆、赤巴衰弱，培根偏盛，从而诱发的培根型肺病。据此，本课题选用具有补肺、活血、治培根功效的代表性藏药沙棘进行治疗慢性支气管炎的实验研究。
藏药沙棘（(gh·gl)，达布）为胡颓子科沙棘属植物沙棘（HippophaerhamnoidesL.）的干燥成熟果实。该药始载于《月王药诊》，藏药经典著作《四部医典》中亦有记载并肯定其为治疗呼吸道疾病的要药，《晶珠本草》中记载：沙棘味酸、性寒，具有治肺病，祛痰，活血，治培根的作用。以沙棘为君药的藏药成方制剂五味沙棘颗粒具有清热祛痰，止咳定喘的作用。用于久咳，喘促痰多，胸闷气紧等慢性支气管炎的临床病症。现代研究表明，沙棘的主要活性成分为黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、镇咳、祛痰、解痉、以及抗变态反应等药理活性。尽管目前关于沙棘总黄酮（totalflavonoidsfromSeabuckthorn，TFSB）药理作用的研究较多，但针对其治疗慢性支气管炎的药效学及潜在分子作用机制仍不系统。因此，本研究提出“藏药沙棘总黄酮（TFSB）具有调节慢性支气管炎的气道炎症和黏液分泌作用”的假说，对其治疗慢性支气管炎的药效学和作用机制进行探讨。
目的
1结合藏医三因学说之培根的性质、特征，探讨培根与慢性支气管炎的病因病机，治法治则。
2预测及筛选TFSB治疗慢性支气管炎的活性成分及核心靶标。
3对TFSB治疗慢性支气管炎进行药效学实验，探索其抗炎和抑制黏蛋白分泌的分子机制。
方法
1查阅《四部医典》《月王药诊》《贡珠藏医纪要及其注释》等藏医经典著作，以“罗乃提波”、“培劳症”和“培根型肺病”为关键词，运用CNKI等文献数据库检索，对相关文献信息进行归纳、分析、总结。
2利用TCMSP数据库筛选TFSB成分，通过PharmMapper网络服务系统、BATMAN-TCM网络药理学研究平台、DrugBank、OMIM数据库预测并匹配TFSB有效成分作用于慢性支气管炎的潜在靶点，借助MAS3.0进行GO富集和KEGG通路注释分析，采用Cytoscape3.5.1软件构建TFSB治疗慢性支气管炎的“成分-靶点-通路”网络，探索TFSB治疗慢性支气管炎的关键靶点及作用通路。
3结合上述网络药理学分析结果，将核心成分选为候选配体分子，通过Ligprep向导应用于配体准备，形成配体的3D构象。从蛋白质数据库检索核心靶点的结构，进行原始PDB结构的蛋白质修饰。通过GLIDE方法进行分子对接程序，其输出GScore以kcal/mol计算，通过标准可视化分析进行特异性配体-蛋白质相互作用模式分析。
4以脂多糖（LPS）联合香烟烟雾提取物（CSE）刺激人支气管上皮细胞HBE16，建立体外支气管炎模型。采用CCK8法检测TFSB对HBE16细胞的毒性作用。以RT-qPCR法检测TFSB对LPS/CSE诱导的HBE16细胞中IL-1β、IL-6、CXCL1、COX2和MUC5ACmRNA表达的影响。采用ELISA和WB分别检测TFSB对LPS/CSE所致HBE16细胞中IL-1β、IL-6、CXCL1、PGE2和MUC5AC表达的影响。机制研究方面，采用WB检测TFSB对HBE16细胞中LPS/CSE诱导的ERK、Akt及PKCα活化的影响。
5通过LPS滴鼻联合香烟烟雾（CS）暴露，建立慢性支气管炎小鼠模型。通过TFSB干预，检测小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞及总细胞数量。采用HE染色法观察支气管组织病理学改变。采用免疫组织化学法，检测支气管组织中IL-1β、IL-6、COX2、CXCL1和MUC5AC表达。
结果
1“罗乃提波”是藏医三因学说中培根紊乱为主要病机，其中培根黏液增多、变稠，通气不畅、肺功能降低是本病发生、发展的主要矛盾。临床治疗时，应抓住培根黏液增多、肺功能降低两个方面，灵活使用益气养肺，治培根，止咳化痰的药物，则可获佳效。
2通过网络药理学，构建了13个化合物、30个靶蛋白、64个作用通路与TFSB治疗慢性支气管炎之间的相互作用关系。其中，该网络的核心通路为FcepsilonRI、VEGF以及MAPK。核心靶点为MAPK1、PIK3CG、AKT1、PKCα等，上述靶点主要通过蛋白质磷酸化反应、信号转导等生物过程，以及蛋白结合、转移酶活性调节等分子功能，发挥了TFSB治疗慢性支气管炎的作用。
3分子对接结果显示，TFSB所含的主要成分槲皮素、异鼠李素和山奈素分别与MAPK1、PIK3CG、PKCα等靶点有效结合。其中，槲皮素和异鼠李素与蛋白靶点对接评分较高，与MAPK1的结合能分别为-7.28和-7.859kcal/mol，与PIK3CG的结合能分别为-8.427和-9.415kcal/mol。
4TFSB可显著降低LPS/CSE诱导的HBE16细胞中IL-1β、IL-6、CXCL1和MUC5AC的基因和蛋白表达水平。同时，TFSB也能明显抑制LPS/CSE所致的COX2表达升高，从而抑制PGE2的生成。机制研究表明，TFSB可明显抑制HBE16细胞中LPS/CSE诱导的ERK、Akt及PKCα活化。
5动物实验表明，TFSB可显著改善LPS/CS暴露所致的小鼠体重降低。明显减少LPS/CS暴露诱导的肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞及总细胞数量的升高。同时，组织学检测表明，TFSB可明显改善因LPS/CS暴露诱导的支气管部位炎性细胞浸润和气道重塑现象。最后，免疫组织化学结果表明，TFSB可有效降低LPS/CS诱导的小鼠支气管组织中IL-1β、IL-6、COX2、CXCL1和MUC5AC的表达。
结论
1从藏医经典理论揭示了“培根黏液增盛”是导致慢性支气管炎发病的重要因素，提出了慢性支气管炎从“培根黏液”论治的理论基础，为后续药效学实验提供了藏医理论依据。
2TFSB可能通过阻断ERK、PI3K/Akt和PKC信号通路，抑制LPS/CS所致的IL-1β、IL-6、COX2、PGE2、MUC5AC诱导性高表达，从而发挥治疗慢性支气管炎的作用。
藏药沙棘（(gh·gl)，达布）为胡颓子科沙棘属植物沙棘（HippophaerhamnoidesL.）的干燥成熟果实。该药始载于《月王药诊》，藏药经典著作《四部医典》中亦有记载并肯定其为治疗呼吸道疾病的要药，《晶珠本草》中记载：沙棘味酸、性寒，具有治肺病，祛痰，活血，治培根的作用。以沙棘为君药的藏药成方制剂五味沙棘颗粒具有清热祛痰，止咳定喘的作用。用于久咳，喘促痰多，胸闷气紧等慢性支气管炎的临床病症。现代研究表明，沙棘的主要活性成分为黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗病毒、镇咳、祛痰、解痉、以及抗变态反应等药理活性。尽管目前关于沙棘总黄酮（totalflavonoidsfromSeabuckthorn，TFSB）药理作用的研究较多，但针对其治疗慢性支气管炎的药效学及潜在分子作用机制仍不系统。因此，本研究提出“藏药沙棘总黄酮（TFSB）具有调节慢性支气管炎的气道炎症和黏液分泌作用”的假说，对其治疗慢性支气管炎的药效学和作用机制进行探讨。
目的
1结合藏医三因学说之培根的性质、特征，探讨培根与慢性支气管炎的病因病机，治法治则。
2预测及筛选TFSB治疗慢性支气管炎的活性成分及核心靶标。
3对TFSB治疗慢性支气管炎进行药效学实验，探索其抗炎和抑制黏蛋白分泌的分子机制。
方法
1查阅《四部医典》《月王药诊》《贡珠藏医纪要及其注释》等藏医经典著作，以“罗乃提波”、“培劳症”和“培根型肺病”为关键词，运用CNKI等文献数据库检索，对相关文献信息进行归纳、分析、总结。
2利用TCMSP数据库筛选TFSB成分，通过PharmMapper网络服务系统、BATMAN-TCM网络药理学研究平台、DrugBank、OMIM数据库预测并匹配TFSB有效成分作用于慢性支气管炎的潜在靶点，借助MAS3.0进行GO富集和KEGG通路注释分析，采用Cytoscape3.5.1软件构建TFSB治疗慢性支气管炎的“成分-靶点-通路”网络，探索TFSB治疗慢性支气管炎的关键靶点及作用通路。
3结合上述网络药理学分析结果，将核心成分选为候选配体分子，通过Ligprep向导应用于配体准备，形成配体的3D构象。从蛋白质数据库检索核心靶点的结构，进行原始PDB结构的蛋白质修饰。通过GLIDE方法进行分子对接程序，其输出GScore以kcal/mol计算，通过标准可视化分析进行特异性配体-蛋白质相互作用模式分析。
4以脂多糖（LPS）联合香烟烟雾提取物（CSE）刺激人支气管上皮细胞HBE16，建立体外支气管炎模型。采用CCK8法检测TFSB对HBE16细胞的毒性作用。以RT-qPCR法检测TFSB对LPS/CSE诱导的HBE16细胞中IL-1β、IL-6、CXCL1、COX2和MUC5ACmRNA表达的影响。采用ELISA和WB分别检测TFSB对LPS/CSE所致HBE16细胞中IL-1β、IL-6、CXCL1、PGE2和MUC5AC表达的影响。机制研究方面，采用WB检测TFSB对HBE16细胞中LPS/CSE诱导的ERK、Akt及PKCα活化的影响。
5通过LPS滴鼻联合香烟烟雾（CS）暴露，建立慢性支气管炎小鼠模型。通过TFSB干预，检测小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞及总细胞数量。采用HE染色法观察支气管组织病理学改变。采用免疫组织化学法，检测支气管组织中IL-1β、IL-6、COX2、CXCL1和MUC5AC表达。
结果
1“罗乃提波”是藏医三因学说中培根紊乱为主要病机，其中培根黏液增多、变稠，通气不畅、肺功能降低是本病发生、发展的主要矛盾。临床治疗时，应抓住培根黏液增多、肺功能降低两个方面，灵活使用益气养肺，治培根，止咳化痰的药物，则可获佳效。
2通过网络药理学，构建了13个化合物、30个靶蛋白、64个作用通路与TFSB治疗慢性支气管炎之间的相互作用关系。其中，该网络的核心通路为FcepsilonRI、VEGF以及MAPK。核心靶点为MAPK1、PIK3CG、AKT1、PKCα等，上述靶点主要通过蛋白质磷酸化反应、信号转导等生物过程，以及蛋白结合、转移酶活性调节等分子功能，发挥了TFSB治疗慢性支气管炎的作用。
3分子对接结果显示，TFSB所含的主要成分槲皮素、异鼠李素和山奈素分别与MAPK1、PIK3CG、PKCα等靶点有效结合。其中，槲皮素和异鼠李素与蛋白靶点对接评分较高，与MAPK1的结合能分别为-7.28和-7.859kcal/mol，与PIK3CG的结合能分别为-8.427和-9.415kcal/mol。
4TFSB可显著降低LPS/CSE诱导的HBE16细胞中IL-1β、IL-6、CXCL1和MUC5AC的基因和蛋白表达水平。同时，TFSB也能明显抑制LPS/CSE所致的COX2表达升高，从而抑制PGE2的生成。机制研究表明，TFSB可明显抑制HBE16细胞中LPS/CSE诱导的ERK、Akt及PKCα活化。
5动物实验表明，TFSB可显著改善LPS/CS暴露所致的小鼠体重降低。明显减少LPS/CS暴露诱导的肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞及总细胞数量的升高。同时，组织学检测表明，TFSB可明显改善因LPS/CS暴露诱导的支气管部位炎性细胞浸润和气道重塑现象。最后，免疫组织化学结果表明，TFSB可有效降低LPS/CS诱导的小鼠支气管组织中IL-1β、IL-6、COX2、CXCL1和MUC5AC的表达。
结论
1从藏医经典理论揭示了“培根黏液增盛”是导致慢性支气管炎发病的重要因素，提出了慢性支气管炎从“培根黏液”论治的理论基础，为后续药效学实验提供了藏医理论依据。
2TFSB可能通过阻断ERK、PI3K/Akt和PKC信号通路，抑制LPS/CS所致的IL-1β、IL-6、COX2、PGE2、MUC5AC诱导性高表达，从而发挥治疗慢性支气管炎的作用。