论文部分内容阅读
研究目的:非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）在全球多个地区的发病率逐年增加,在肥胖人群中的发病率更是高达58%74%。NAFLD是一种临床综合征,指与胰岛素抵抗相关的肝脏脂肪过度蓄积,肝活检显示5%以上肝细胞脂肪变;同时需除外酒精性和其他明确因素所致的肝损害;“非酒精性”是指男性每天乙醇摄入量少于30克而女性少于20克;NAFLD实则为一疾病谱,是从非酒精性单纯性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver,NAFL）、至非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH）再到肝细胞癌的一个连续过程。NASH是NAFLD最重要的阶段,从NAFL进展至NASH是NAFLD发展的关键步骤。NAFLD发生发展涉及多种机制,包括氧化应激、炎症、内质网应激及脂毒性等等。而“二次打击”学说仍被认为是最重要的发病机制,故改善氧化应激是防治NAFLD的关键靶点之一。在对抗氧化应激方面,机体抗氧化酶系统起着关键作用。其中,转录因子NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor2,Nrf2）通路所介导的抗氧化酶系统对NAFLD尤其是NASH起到保护作用。目前已经发现众多物质,如姜黄素等可以激活Nrf2通路,但大都很难用于临床治疗。近年研究结果发现维生素D具有免疫调节、抗炎、抗纤维化、抗氧化应激等作用,且多项研究证实维生素D在多种肝脏疾病（如丙型肝炎）中起到抗炎等重要作用。虽然维生素D有一定的抗氧化作用,但维生素D与NAFLD的氧化应激之间关系的研究报道并不多见。我们推测维生素D很可能通过缓解氧化应激对NAFLD起到保护作用。本研究主要观察活性维生素D-1,25（OH）2D3是否上调肝细胞Nrf2通路,增强其下游抗氧化信号因子的表达,减轻氧化应激,延缓NASH的进展,为NAFLD防治提供新思路。研究内容:高脂喂养大鼠建立NAFLD动物模型,观察在高剂量1,25（OH）2D3干预下,大鼠肝脏NAFLD病理改变并评价Nrf2通路信号因子表达的变化。高脂和1,25（OH）2D3干预HepG2细胞,评价细胞中氧化应激程度,并检测抗氧化酶活性和Nrf2通路信号因子表达的变化。研究方法:第一部分为体内试验（动物实验）:共36只雄性SD大鼠,首先随机分为普通饲料组10只,高脂饲料组26只,适应性喂养4周。高脂饲料组再随机分为高脂组（HFD组,n=13）和高脂1,25（OH）2D3干预组（HFD+VD组,n=13,1,25（OH）2D3 5μg/kg,腹腔注射,每周两次）,再喂养16周后处死大鼠。记录大鼠一般情况,处死后测量肝重,计算肝重-胫骨比,行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验证明是否存在胰岛素抵抗;检测血肝功能、血脂、钙磷及肝内甘油三酯生化指标,制备肝脏石蜡切片,行HE、Masson和油红O染色方法观察肝脏炎症、纤维化和脂肪变程度,并评价肝脏病理改变;应用免疫组织化学方法测定肝组织细胞中Nrf2蛋白表达;测定大鼠肝脏氧化应激指标,包括丙二醛和8-异前列腺素F2α;qRT-PCR方法测定Nrf2及其靶基因mRNA表达水平。第二部分为体外试验（细胞实验）:采用人肝癌细胞HepG2细胞系作为研究对象,分为对照组（CON组）、高脂培养组（HF组,软脂酸:油酸=1:2,0.1mmol/l）和高脂1,25（OH）2D3干预组(HF+VD组,1,25（OH）2D3,10-7mol/L)。应用油红O染色观察各组HepG2细胞脂质形成情况,测定高脂诱导HepG2细胞氧化应激指标（丙二醛）和抗氧化酶活性（过氧化氢酶和总超氧化物歧化酶）,qRT-PCR方法检测Nrf2及其靶基因mRNA表达水平,应用western-blot方法测定HepG2细胞及细胞核内NRF2蛋白表达水平。本实验统计学方法均采用单因素方差分析对各组间数据进行分析。研究结果:1.体内试验:通过高脂喂养SD大鼠20周成功建立了胰岛素抵抗NAFLD大鼠模型。与CON组相比,HFD组大鼠血转氨酶、胆固醇、甘油三酯和肝内甘油三酯水平显著升高;经1,25（OH）2D3干预后,上述指标显著降低。HFD组大鼠肝脏病理显示脂肪样变、气球样变、炎细胞浸润,肝脏脂肪样变、炎症、纤维化评分均显著增高;而HFD+VD组大鼠肝脏脂滴数量、炎症细胞浸润程度及纤维化程度均有所改善、各项评分均较HFD组明显降低。免疫组化染色显示NRF2主要在HFD组肝细胞胞浆中表达;而在活性维生素D干预后核转移明显增多。PCR结果提示Nrf2 mRNA表达无明显变化,但是其下游靶基因表达水平增高。2.体外试验:高脂干预人肝癌细胞HepG2细胞后细胞内脂质沉积明显增多;而1,25（OH）2D3则减少脂质沉积。高脂干预HepG2细胞后24h和48h丙二醛水平均明显增高,抗氧化酶活性减低;而1,25（OH）2D3干预后丙二醛水平下降,抗氧化酶活性增高,Nrf2靶基因mRNA表达水平均明显上调。Western-blot实验结果提示NRF2细胞核内表达随1,25（OH）2D3干预时间的延长明显增加。结论:高脂喂养雄性SD大鼠20周后出现胰岛素抵抗、肝功能及血脂异常,肝组织具有典型NAFLD病理改变;高剂量1,25（OH）2D3干预NAFLD大鼠,可以改善肝功能、高血脂和肝内甘油三酯含量,并减轻NAFLD病理表现。1,25（OH）2D3促进Nrf2向细胞核内转移,上调其下游靶基因抗氧化酶的表达,从而减轻NAFLD病变。