随着RNA干扰(RNA interference,RNAi)概念的提出及相应技术推广应用,人们对预防HCV感染的思路得以拓宽。以RNAi为主线,研究者们通过多种途径提高RNA干扰的效率及稳定性。长期以来,因为缺乏适合的细胞培养体系和动物模型,HCV的研究较为缓慢。HCVcc(cell cultured HCV virus,HCVcc)及HCVpp(HCV infectious pseudotype particles,HCVpp)的成功构建,为HCV的研究提供了体外平台,这大大促进了HCV感染机制的研究步伐,为我们开辟了一个崭新的时代。 RNA干扰技术是近年来产生的新兴生物技术。RNAi作用的基本原理是双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)结合核酶复合物形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),激活的RISC通过过碱基配对定位到同源mRNA转录体上并切割mRNA,进而破坏特定目的基因转录产生的mRNA,使其功能沉默。由于siRNA作用的阶段是在目的基因转录成为mRNA以后,即转录后,所以RNAi引导的基因沉默又称转录后基因沉默(PTGS)。 HCV基因组是一条长约9.6kb的正链RNA,包括5非编码区(5NTR)、开放读码框架(ORF)以及3非编码区(3NTR)。由于其本身就是RNA,所以HCV天生就是基于RNAi治疗的合适对象。 单从RNA干扰的角度,可以从两个方面阻断HCV的感染。其一是寻找筛选靶向于HCV基因组本身的RNAi序列,抑制HCV在细胞内的复制。其二是选择靶向于HCV易感细胞HCV入侵感染相关因子的RNAi序列,干扰HCV与靶细胞结合、穿入、复制等多个层面,达到抗病毒的目的。然而,HCV的高度变异性使得针对于HCV基因组本身的RNAi很难发挥持久有效的作用。于是,人们把目光转移到对HCV入侵复制相关因子的干扰上来。 CD81分子属于四跨膜蛋白(tetraspanin)超家族成员,又称TAPA-1,是跨膜四次、分子量为26 kD的细胞表面非糖基化蛋白,该分子在各种细胞上有广泛表达。已有的研究表明,CD81与HCV包膜蛋白E2的相互识别是介导HCV入胞的重要事件,CD81也因此作为HCV最重要的候选受体而倍受关注。在该部分论文中,我们主要以CD81作为靶分子,探讨CD81的RNA干扰在抗HCV感染中的作用。 一.人CD81特异性siRNA的筛选及CD81稳定干扰细胞株的构建 在本研究中,我们首先设计了6段分别针对CD81不同区域的siRNA序列,合成了相应的DNA模板,通过体外转录及纯化制备出了高纯度siRNA产物。将制备的6种siRNA与本室构建的CD81-EGFP融合蛋白表达质粒电穿孔或者脂质体法共转染人胚肾HEK 293T细胞,转染72h后,荧光显微镜观察各siRNA转染细胞并行流式细胞术精确定量GFP(+)细胞数。同时,裂解部分细胞行Western blot检测各siRNA转染细胞CD81-EGFP融合蛋白的表达水平。抽提各siRNA转染细胞总RaNA行FQ-PCR,检测各样品CD81 mRNA水平。蛋白质水平及mRNA水平结果显示,6段siRNA均发挥了作用,能够抑制融合蛋白CD81-EGFP的表达,其中以靶向于CD81 3NTR区的2段siRNA最为有效,分别使CD81-EGFP融合蛋白表达水平下降了84％和87％,mRNA水平下降了87％ 和90％。为进一步验证6段siRNA对内源性CD81的抑制效应,我们在人肝癌细胞系Huh7.5细胞中进行了第二轮筛选,发现各siRNA对Huh7.5细胞内源性CD81的抑制作用与HEK 293T细胞中的趋势相同。我们选择了6段siRNA中最有效的1段,构建shRNA表达质粒pGCsi-CD81,转染Huh7.5细胞,以G418(300mg/L)筛选阳性克隆2-3周,挑选其中11个克隆扩大培养,流式细胞术检测各克隆CD81的表达水平,结果显示各克隆CD81表达均有不同程度的下降。其中克隆C1下降最多,仅为原表达量的8％。将该克隆进一步扩大培养,可作为CD81稳定抑制的Huh7.5细胞株应用于抗HCV感染的功能学分析。 二.CD81shRNA慢病毒表达载体的构建及干扰效果鉴定 质粒介导RNAi有转染率低、基因表达抑制作用弱、持续时间短、不适合体内实验等局限性。慢病毒载体是一种逆转录复制缺陷载体,以HIV-1为基础发展而来,具有感染效率高、能感染非分裂期细胞和分裂期细胞、病毒的遗传物质能整合入宿主的基因组、RNAi作用持久等许多优点。因此,我们构建了CD81shRNA慢病毒表达载体以获得更好的干扰效果。 以第一部分中构建好的CD81shRNA表达质粒pGCsi-CD81为模板,PCR方法扩增出包括U6启动子在内的CD81shRNA DNA序列,测序证实后,SnaBI＆SalI双酶切、连接及转化等步骤成功插入预先切除GFP基因片段的慢病毒表达载体pRRLsin.PPTs.hCMV.GFPpre中,命名为pLenti-shCD81。通过与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装出完整的慢病毒颗粒,感染Huh7.5细胞,体外传代培养7-10d后,行流式细胞术及FQ-PCR检测感染细胞CD81蛋白质和mRNA水平。结果表明,Lenti-shCD81慢病毒感染细胞中的CD81表达被稳定抑制,较之未感染细胞及阴性对照细胞,CD81表达下降了94％左右。随后,我们收集不同感染天数的细胞重复检测CD81的表达水平,得到的结果同第一次检测结果大体一致。同时,为了确定慢病毒感染及CD81的抑制对细胞是否存在致病效应,我们通过为期1周的MTT实验监测了慢病毒感染Huh7.5细胞的生长增殖情况并绘制了生长曲线图。观察发现,空白组、Lenti-shCD81感染组及其阴性对照Lenti-EGFP感染组Huh7.5细胞生长增殖状态大体-致,各组细胞的生长曲线基本重合。以上结果不仅验证了第一部分筛选出的CD81siRNA具有良好的干扰效果,也表明CD81的稳定干扰并不影响细胞的生长增殖,同时也证明了慢病毒载体介导RNAi稳定、高效、安全的特点,显示出慢病毒载体在RNAi中的优越性,为HCV感染的防治提供了新的思路。 三.HCV体外培养体系的建立及CD81稳定抑制细胞株抗HCV感染能力的验证 自1989年发现HCV以来,国内外一直致力于HCV的体外细胞培养,但由于易感物种的局限性,被感染组织和感染者血清中的HCV滴度低以及其自身的高度变异性等原因,在很长一段时间内,HCV体外细胞培养体系都不尽如人意。由于缺乏有效的HCV体外细胞培养体系,严重影响了HCV感染入侵分子机制的研究及抗HCV新药的研发。2003年,Cosset FL实验室利用逆转录病毒载体的两个重要特性(可插入外源糖蛋白；复制缺陷的病毒颗粒可整合并表达报告基因),构建了携带完整的HCV E1与E2包膜糖蛋白的表达质粒,首次制备出具有感染性的HCV假型包膜病毒颗粒(HCVpp)。该假型病毒模型的包膜蛋白源于完整的HCV包膜糖蛋白,可感染肝源性传代细胞(如Huh7.5细胞系)或原代肝细胞,并表达其携带的特定报告基因(如EGFP、Luc或β-Gal等),大大方便了对HCVpp感染的观察和检测。HCVpp呈现出的嗜肝性且可被抗E2的mAb或HCV患者血清中和,故可用作研究HCV感染早期(如宿主嗜性、受体结合、膜融合及血清中和等)的有效模型。2005年,Wakita、Zhong及Lindenbach 3个研究小组先后在特定的细胞系中获得全序列HCV基因组的表达及感染性HCV颗粒(HCVcc)。具有感染性的完整HCV病毒颗粒在体外的成功培养,为HCV的研究揭开了新的篇章。 小结： 1.筛选出1段有效的CD81特异siRNA,构建了CD81shRNA表达质粒pGCsi-CD81并通过转染人肝癌细胞系Huh7.5细胞获得了CD81稳定抑制细胞株。 2.以质粒pGCsi-CD81为基础,构建了包含CD81shRNA序列及U6启动子的shRNA慢病毒表达质粒pLenti-shCD81。通过与辅助质粒共转染,在HEK 293T细胞中包装出具有高感染性的慢病毒上清,感染Huh7.5细胞,得到了CD81高效稳定抑制的细胞株。为研究CD81分子在HCV细胞入侵中的作用提供了良好的基础,同时也有助于筛选其他HCV入侵相关分子。 3.构建了HCV体外细胞培养模型(HCVcc和HCVpp),以此为平台,检验CD81稳定抑制细胞株抗HCV感染能力。通过观察、检测和比较,HCVcc及HCVpp对CD81稳定抑制Huh7.5细胞株的感染率远远低于空白及阴性对照组细胞,证实了CD81分子在HCV细胞入侵中的重要作用,显示出CD81 RNAi在抗HCV感染中的强大作用,为进一步的体内实验奠定了基础,同时也揭示了RNAi在抗HCV治疗中的巨大潜力。