【摘 要】
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骨形态发生蛋白II型受体（Bone Morphogenetic Protein Receptor Type 2,BMPR2）是BMP家族受体之一,通过Smad信号通路转导信号。目前研究发现非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）调控哺乳动物的生物进程、组织发育、细胞增殖和分化,但对于nc RNA调控牛卵泡颗粒细胞功能的分子机制还不完全清晰。本研究运用课题组前期对牛卵泡颗粒细胞全转
【基金项目】
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山西省重点研发计划项目（201603D421006）； 青年三晋学者专项； 山西省基础研究计划项目（20210302123393）； 大同市重点研发计划项目（2021027）； 山西省“1331 工程”工程技术研究中心建设项目；
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骨形态发生蛋白II型受体（Bone Morphogenetic Protein Receptor Type 2,BMPR2）是BMP家族受体之一,通过Smad信号通路转导信号。目前研究发现非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）调控哺乳动物的生物进程、组织发育、细胞增殖和分化,但对于nc RNA调控牛卵泡颗粒细胞功能的分子机制还不完全清晰。本研究运用课题组前期对牛卵泡颗粒细胞全转录组测序数据,通过生物信息学预测并构建lnc RNA-BMPR2共表达网络和BMPR2 ce RNA网络;分析了lnc RNA S100PBP的基本特性。双荧光素酶报告试验验证bta-mi R-2285bc与BMPR2 3’UTR和lnc RNA S100PBP的结合情况。RIP试验证明lnc RNA S100PBP通过AGO2蛋白结合bta-mi R-2285bc。体外培养牛卵泡颗粒细胞,探究bta-mi R-2285bc通过BMPR2,以及lnc RNA S100PBP通过ce RNA机制调控BMPR2对卵泡颗粒细胞功能和卵泡发育的影响。本研究的主要结果如下:（1）通过分析课题组前期牛卵泡颗粒细胞全转录组测序数据,预测有19个差异表达（Differentially expressed,DE）lnc RNAs反式调控BMPR2;结合mi Randa、RNAhybrid和皮尔森相关系数分析等方法构建BMPR2 ce RNA网络,其中包含7个lnc RNAs,3个mi RNAs;q RT-PCR试验结果显示BMPR2和以上nc RNAs在正常和囊肿卵泡颗粒细胞表达与测序结果一致。（2）双荧光素酶试验结果显示bta-mi R-2285bc靶向结合BMPR2 3’UTR。转染bta-mi R-2285bc mimics下调牛卵泡颗粒细胞BMPR2 m RNA和蛋白表达量（P＜0.05）;下调BMP/Smad信号通路相关基因Smad1、Smad4和Smad5 m RNA表达量（P＜0.05）;下调细胞增殖相关基因PCNA和CCND2 m RNA表达量（P＜0.05）;同时抑凋亡基因BCL2m RNA表达量和BCL2/BAX比值显著减少（P＜0.05）;细胞凋亡相关基因Caspase3 m RNA表达量显著升高（P＜0.05）;颗粒细胞活力降低（P＜0.05）;类固醇激素合成相关基因CYP11A1、HSD3B1和STAR m RNA表达量显著减少（P＜0.05）;卵泡颗粒细胞合成类固醇激素E2和P4的能力减弱（P＜0.05）;卵泡囊肿形成相关基因CDH1和ITGB1 m RNA表达量下降（P＜0.05）。bta-mi R-2285bc inhibitor上调卵泡颗粒细胞BMPR2 m RNA和蛋白表达量（P＜0.05）;同时上调Smad1、Smad4、Smad5、Smad9、PCNA、CCND2、CYP11A1、CYP19A1、HSD3B1、STAR、CDH1、ITGB1 m RNA表达量（P＜0.05）;下调BAX和Caspase3m RNA表达量（P＜0.05）;卵泡颗粒细胞活性增强（P＜0.05）;E2和P4分泌增多（P＜0.05）。（3）lnc RNA S100PBP全长1906 nt,位于牛第二号染色体上,无蛋白编码能力,在牛卵泡颗粒细胞核与质中均有分布。双荧光试验结果表明该lnc RNA与bta-mi R-2285bc靶向结合。单独转染si-lnc RNA S100PBP与si NC或si-lnc RNA S100PBP+inhibitor组相比,BMPR2 m RNA和蛋白表达量显著下降（P＜0.05）;BMP/Smad信号通路相关基因Smad1、Smad5、Smad9和Smad4 m RNA表达量显著下降（P＜0.05）;细胞增殖相关基因PCNA和CCND2 m RNA表达量显著降低（P＜0.05）;细胞凋亡相关基因BAX和Caspase3 m RNA表达量显著上升（P＜0.05）;类固醇激素合成相关基因CYP19A1、CYP11A1、HSD3B1和STAR m RNA表达量显著下降（P＜0.05）;颗粒细胞活力减弱（P＜0.05）;合成类固醇激素P4和E2的能力减弱（P＜0.05）;卵泡囊肿形成相关基因CDH1和ITGB1 m RNA表达下降（P＜0.05）。但si NC与si-lnc RNA S100PBP+inhibitor组相比,结果均无明显差异（P＞0.05）。综上所述,bta-mi R-2285bc通过抑制BMPR2表达,抑制BMP/Smad通路相关基因的表达,促进卵泡颗粒细胞凋亡,抑制颗粒细胞增殖,减少E2和P4合成,并且潜在促进卵泡囊肿形成;lnc RNA S100PBP与BMPR2竞争结合bta-mi R-2285bc,促进BMP/Smad通路相关基因的表达,抑制卵泡颗粒细胞凋亡,促进颗粒细胞增殖,促进E2和P4合成,并潜在抑制卵泡囊肿形成。
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