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研究背景三氯乙烯（Trichloroethylene,TCE）是一种具有良好清脂能力的有机溶剂,在工业领域被广泛应用。少数职业暴露于TCE的工人可出现类似于药疹出现皮肤的坏死和剥脱,并伴有肝、肾等多脏器损伤,在我国将其定义一种法定职业性皮肤病,命名为“职业性三氯乙烯药疹样皮炎”（OMDT）。肾脏损伤往往可影响OMDT病程进展,加重该疾病严重程度,然而其机制尚未完全阐明。既往研究发现TNF-α在OMDT肾脏损伤中发挥着关键作用,然而具体机制不清。TNF-α主要通过激活细胞凋亡、程序性细胞坏死和NF-κB信号通路,参与细胞的存活和死亡等多种生物过程。前期课题组电镜和HE染色结果发现TCE致敏阳性小鼠的肾小管上皮细胞具有坏死的形态学特征。程序性坏死是一种新发现的免疫原性程序性细胞死亡形式,TNF-α可启动RIPK3/MLKL程序性坏死信号通路的激活,诱导细胞膜破裂,加重肾脏疾病炎症反应。近年来的研究表明,程序性坏死在肾脏疾病的肾小管炎症反应放大中发挥了重要作用。TNF-α是否通过启动肾小管上皮细胞程序性坏死介导TCE致敏所致的肾脏损伤值得探讨。研究目的本研究的主要目的是探讨TNF-α/TNFR1轴是否通过启动肾小管上皮细胞程序性坏死介导TCE致敏所致的肾脏损伤。通过建立TCE致敏BALB/c小鼠模型,采用腹腔注射R7050（TNF-α受体拮抗剂）作为预处理,抑制TNF-α/TNFR1的下游分子表达,检测小鼠肾脏病理学以及肾功能改变,TNF-α、TNFR1、RIPK3、MLKL以及HMGB1在肾脏的表达水平以及定位情况,从而探讨TCE致敏小鼠肾小管炎性损伤的具体机制。并通过检测OMDT患者的尿液α1-MG、β2-MG、NGAL和血清TNF-α表达水平,进一步为动物实验提供证据支持。研究方法2017年1月至2021年1月在广东省职业病防治医院收集7名OMDT患者和21名正常对照作为受试者,OMDT患者入院后给予抗感染、护肝退黄、血浆置换、抗过敏以及糖皮质激素联合丙种球蛋白等对症治疗,收集患者治疗前后以及正常对照的血清和尿液进行生物学检测。首先我们检测尿液α1-MG、β2-MG和NGAL表达水平评估OMDT患者肾小管损伤情况,同时检测其血清炎症因子TNF-α的表达水平。71只BALB/c雌性小鼠在适应性喂养结束后,按体重随机分为四组,分别是空白对照组（6只）、溶剂对照组（6只）、TCE处理组（30只）和TCE+R7050联合处理组（29只）。根据课题组前期建模方法,建立TCE致敏BALB/c小鼠模型。在第17和19天终末次激发前2小时,TCE+R7050联合处理组小鼠腹腔注射100μl含有R7050（12mg/kg）的磷酸盐缓冲液。在末次激发24小时后,对小鼠背部反应进行评分。根据背部皮肤反应评分标准,判定致敏阳性和阴性组。即分为TCE致敏阳性和阴性组,TCE+R7050致敏阳性和阴性组。末次激发后72小时后,无菌获得小鼠血清和肾脏。血清用于检测小鼠肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）、α1微球蛋白（α1-MG）、β2微球蛋白（β2-MG）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）。取部分肾脏制作成石蜡切片用于小鼠肾脏病理性结构损伤检测;免疫荧光双标检测p-RIPK3和p-MLKL与肾小管上皮细胞的共定位;免疫组化法检测TNF-α、TNFR1和HMGB1在小鼠肾脏的沉积水平;蛋白免疫印迹检测TNF-α、TNFR1、RIPK3/p-RIPK3和MLKL/p-MLKL的蛋白表达水平。研究结果1 ELISA检测结果发现,相比患者治疗后和正常对照,治疗前OMDT患者尿液肾小管功能指标α1-MG、β2-MG和NGAL水平以及血清TNF-α水平明显升高。2 TCE致敏模型建立完成后,进行评估小鼠皮肤的致敏情况。空白和溶剂对照组小鼠皮肤无明显变化,致敏小鼠皮肤出现不同程度的红斑和水肿;TCE处理组和TCE+R7050联合处理组小鼠的致敏率分别为33.33%和31.03%,差异无统计学意义（P＞0.05）。3小鼠皮肤HE染色结果显示,TCE致敏阳性组的表皮细胞间隙增宽,表皮层出现明显增厚,真皮层出现大量的炎性细胞浸润。而空白对照组、溶剂对照组,TCE致敏阴性组未发现明显的皮肤病理损伤,表皮层无明显增厚。4小鼠肾脏HE染色结果显示,空白及溶剂对照组、TCE致敏阴性组和TCE+R7050致敏阴性组小鼠肾脏均未发现明显的病理损伤,TCE致敏阳性组小鼠肾脏可以观察到肾小管上皮细胞肿胀,空泡变性及肾间质发生水肿,而TCE+R7050致敏阳性组小鼠的病理损伤减轻。5小鼠血清的肾（肾小管）功能指标检测结果显示,空白对照组、溶剂对照组和TCE致敏阴性组CRE、BUN、ALB、α1-MG和β2-MG水平无明显差异（P＞0.05）。TCE致敏阳性组和TCE+R7050致敏阳性组小鼠CRE、BUN、ALB、α1-MG和β2-MG水平明显升高（P＜0.05）,而TCE+R7050致敏阳性组小鼠较TCE致敏阳性组肾（肾小管）功能有一定程度的恢复。6小鼠肾脏组织透射电镜结果显示,空白及溶剂对照组、TCE致敏阴性组肾小管上皮细胞线粒体结构正常,线粒体嵴清晰可见,刷状缘整齐,无损伤表现。TCE致敏阳性组小鼠肾小管上皮细胞出现细胞膜破裂,内质网扩张,线粒体水肿,空泡变性等程序性坏死形态学特征改变。7通过免疫荧光和蛋白质免疫印迹对小鼠RIPK3/MLKL程序性坏死通路的表达情况进行检测。通过肾小管上皮细胞标志蛋白CK18与p-RIPK3和p-MLKL蛋白免疫荧光双标发现在TCE致敏阳性组中,p-RIPK3和p-MLKL主要表达在肾小管上皮细胞,而TCE+R7050致敏阳性组中表达明显减少（P＜0.05）。蛋白质免疫印迹的结果表明TCE致敏阳性组的p-RIPK3和p-MLKL表达明显升高,TCE+R7050致敏阳性组中相比TCE致敏阳性组p-RIPK3和p-MLKL的表达显著下降（P＜0.05）。其他各组未见明显表达（P＞0.05）。8免疫组化结果显示TCE致敏阳性小鼠的受损的肾小管出现HMGB1发生核质移位,而相比TCE致敏阳性组,TCE+R7050致敏阳性组肾小管的HMGB1核质移位明显减少。空白对照组、溶剂对照组、TCE致敏阴性组和TCE+R7050致敏阴性组的HMGB1主要在细胞核高表达。小鼠血清HMGB1的ELISA结果显示,空白对照组、溶剂对照组和TCE致敏阴性组HMGB1表达水平无明显差异（P＞0.05）。TCE致敏阳性组和TCE+R7050致敏阳性组小鼠HMGB1表达水平明显升高,而TCE+R7050致敏阳性组小鼠较TCE致敏阳性组HMGB1表达水平有一定程度的下降（P＜0.05）。9通过免疫组化和蛋白质免疫印迹对小鼠TNF-α/TNFR1轴的表达情况进行检测。免疫组化结果显示TCE致敏阳性组小鼠受损肾小管出现大量的TNF-α和TNFR1沉积。与TCE致敏阳性组相比,TCE+R7050致敏阳性组中TNF-α和TNFR1沉积明显减少（P＜0.05）。蛋白质免疫印迹的结果表明TCE致敏阳性组的TNF-α和TNFR1表达明显升高,TCE+R7050致敏阳性组中相比TCE致敏阳性组TNF-α和TNFR1的表达显著下降（P＜0.05）。其他各组未见明显表达（P＞0.05）。10小鼠肾脏HE染色结果显示TCE+R7050致敏阳性组相比TCE致敏阳性组的肾小管细胞的形态学改变得到改善。小鼠血清的肾（肾小管）功能指标检测结果显示,与TCE致敏阳性组相比,TCE+R7050致敏阳性组小鼠血清中的CRE、BUN、ALB和β2-MG水平降低（P＜0.05）。结论1 RIPK3/MLKL介导的肾小管上皮细胞坏死可能参与了TCE致敏所致的肾脏炎性损伤,而TNF/TNFR1轴可能是RTECs坏死的关键触发器。2我们的结果在一定程度上支持了以TNF-α/TNFR1轴作为OMDT患者临床治疗的靶点,R7050可能成为一种具有临床应用潜力的新靶向药物。