羊泰勒虫病是由泰勒科泰勒属(Theileria)的原虫寄生于山羊、绵羊以及其他野生动物巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内引起的一类蜱传病。该病危害严重,以体表淋巴结肿大、高热、贫血和黄疸等为特征。目前,羊泰勒虫病以化学药物防治为主,但近年来发现泰勒虫已对传统的药物(如贝尼尔)产生了耐药性,同时,化学药物又会引起动物产品药物残留和环境污染,因此疫苗免疫成为防治泰勒虫病最具前景的措施之一。吕氏泰勒虫TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)是在吕氏泰勒虫子孢子和裂殖体阶段表达于寄生虫膜的表面蛋白,是研制抗泰勒虫疫苗的候选抗原。本研究将TlSP的免疫优势区在毕赤酵母中进行表达,制备成亚单位疫苗,评价重组TlSP亚单位疫苗的免疫保护效果。现将研究内容总结如下:1.通过RT-PCR扩增TlSP基因的cDNA序列,对TlSP基因序列进行了生物信息学分析。结果显示:获得TlSP的cDNA序列为888 bp,与其他种泰勒虫在核苷酸水平同源性均在94%以上;TlSP靠近C端存在两个跨膜区,在N端的1~184 aa位于寄生虫膜表面,含有B细胞表位,为免疫优势区域。2.将TlSP的免疫优势区域克隆至pPIC9K,构建重组质粒pPIC9K-TlSP,转化至毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素(G418)筛选后得到高拷贝菌株,进行诱导表达。结果显示:筛选得到抗4.0 mg/mL遗传霉素的GS115菌株5株,KM71菌株7株,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应。3.将重组TlSP抗原与佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,制备抗原浓度不同的两种亚单位疫苗。免疫组A和免疫组B接种抗原量分别为600μg和300μg,对照组接种等量PBS制备的疫苗。于0天、21天和35天进行第一次免疫、第二次免疫和攻蜱试验,评价重组TlSP亚单位疫苗的免疫保护效果。结果显示,对照组绵羊出现高热、贫血和淋巴结肿胀等临床症状,免疫组只出现轻微贫血。对照组、免疫组A和免疫组B最早分别在20天、36天和29天发现虫体,最高染虫率分别为8.6%、1.12%和3%。对照组、免疫组A和免疫组B抗体最高效价分别为1∶8 192、1∶65 536和1∶32 768。TlSP重组亚单位疫苗能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,提高机体IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平。