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研究背景： 衰老是机体一系列生理及病理变化的过程，而心脏的衰老是心血管系统及其他器官变化的集中体现。生理情况下，心脏存在低水平的自噬，用于维持正常的心脏结构和功能。而在很多病理情况下，则有明显的自噬活动的增加。过多的自噬导致心肌细胞发生自噬性细胞死亡，加重心脏的损伤;而抑制心肌细胞自噬，则可以明显改善衰老心脏功能。研究表明，在胚胎成纤维细胞中线粒体促凋亡蛋白Omi/HtrA2能够促进自噬的发生。我们的前期研究发现，衰老大鼠心肌组织中Omi/HtrA2蛋白表达增加，那么衰老心肌中增多的Omi/HtrA2是否也可参与了衰老心肌细胞自噬？对这一问题的研究，将有助于探讨衰老心肌中增加的Omi/HtrA2与心肌细胞自噬的关系，为Omi/HtrA2作为调节心肌细胞自噬提供实验依据。 研究目的： 利用D-半乳糖干预胎鼠心肌细胞系H9c2建立衰老细胞模型使Omi/HtrA2表达增加，利用慢病毒稳转H9c2心肌细胞系过表达Omi/HtrA2，观察心肌细胞自噬水平，探讨衰老心肌细胞中增加的Omi/HtrA2在心肌细胞自噬中的作用。 实验方法： 1、细胞培养及处理:选用22-28代细胞用于实验，将H9c2心肌细胞消化后得到的单细胞悬液，调节细胞密度至(5-6)×105个/ml后，接种于6孔板中。实验分组如下:(1)H9c2心肌细胞Omi/HtrA2过表达组:利用慢病毒载体转染使H9c2心肌细胞过表达Omi/HtrA2;(2)D-半乳糖干预衰老组:D-半乳糖(8g/L)诱导H9c2心肌细胞衰老组;(3)ucf-101组:10-5mol/Lucf-101作用组;(4)H9c2心肌细胞对照组。8g/LD-半乳糖诱导H9c2衰老实验处理时间为5天，10-5mol/Lucf-101作用于细胞时间为72h，各处理组n值均为6，检验各项指标。 2、检测指标:(1)细胞衰老情况:光学显微镜下观察β-半乳糖苷酶染色情况;(2)细胞存活率:CCK8染色试剂盒检测法;(3)细胞损伤情况:比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;(4)Gateway载体构建技术构建各质粒;(5)Westernblot法检测Omi/HtrA2蛋白及自噬相关蛋白LC-3Ⅱ、beclin1的表达。 实验结果： 1.H9c2心肌细胞衰老模型建立 1.1.H9c2心肌细胞衰老模型构建及鉴定 D-半乳糖的不同浓度(0、5、8、10、12g/L)及不同作用时间(3、5、7、10天)对H9c2心肌存活率的影响(P＜0.01;图1)。统计学分析后选择8g/L的浓度作用5天作为D-gal干预H9c2心肌细胞的条件。各组细胞分别进行β-半乳糖苷酶染色，结果显示:与H9c2心肌细胞对照组比较，D-半乳糖干预衰老组β-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高(P＜0.01;图3)。 1.2.D-半乳糖对H9c2心肌细胞存活率和LDH活性的影响 CCK8和LDH检测结果显示:与H9c2心肌细胞对照组比较，D-半乳糖干预下衰老组细胞存活率显著升高，LDH活性显著升高(P＜0.01;图4)。 1.3.衰老H9c2心肌细胞Omi/HtrA2蛋白表达增加 Westernblot结果显示:与H9c2心肌细胞对照组比较，D-半乳糖干预衰老组细胞Omi/HtrA2蛋白表达显著增加（P＜0.05;图5）。 以上结果提示，衰老心肌细胞模型构建成功。 2.质粒构建及细胞转染 2.1.质粒pDown-HtrA2的测序鉴定: pDown-HtrA2质粒直接进行测序，结果显示，pDown-HtrA2质粒的序列全长为1627bp，表明质粒pDown-HtrA2构建成功（图6;表1）。 2.2.重组质粒HtrA2的鉴定: HtrA2质粒直接进行测序，结果显示，HtrA2质粒的序列全长为834bp，表明质粒HtrA2构建成功（图7;表2）。 2.3.重组慢病毒pLV.EX3d.P-neo-EF1A-HtrA2-IRES-eGFP的包装: 镜下结果显示:pLV.EX3d.P-neo-EF1A-HtrA2-IRES-eGFP病毒成功包装(图8A-B); pLV.EX2d.P-neo-EF1A-eGFP病毒包装成功（图9A-B）。 2.4.病毒滴度的测定 镜下计数结果显示:Lenti-neo-EF1A-HtrA2-IRES-eGFP/Neo滴度为4.7×107，Lenti-neo-EF1A-eGFP/Neo滴度5.0×107。 2.5.慢病毒转染H9c2心肌细胞转导率 显微镜下结果显示:H9c2/EGFP-neo转导率达90％（图10A-B），H9c2/HtrA2-EGFP-neo转导率为60％-70％（图11A-B）。 2.6.慢病毒成功转染H9c2心肌细胞 Q-PCR结果显示:H9c2心肌细胞目的基因2-△△CT是100.00％，带有绿色荧光蛋白(eGFP)的目的基因2-△△CT是102.65％，过表达Omi/HtrA2的H9c2心肌细胞目的基因2-△△CT是3728.43％;Q-PCR检测到H9c2/HtrA2心肌细胞中Omi/HtrA2基因过表达（表3;图12A-F）; Westernblot结果显示:与H9c2心肌细胞相比，H9c2/EGFP细胞中Omi/HtrA2蛋白无显著变化，H9c2/HtrA2心肌细胞Omi/HtrA2蛋白表达显著升高（P＜0.05;表4;图13）; 以上结果提示，慢病毒质粒构建及细胞转染成功。 3.稳转H9c2心肌细胞中Omi/HtrA2促进心肌细胞自噬 3.1.稳转H9c2心肌细胞中Omi/HtrA2过表达，自噬水平上升 Westernblot结果显示:与H9c2心肌细胞相比，慢病毒稳转H9c2细胞中LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均显著升高(P＜0.05;图14）; 3.2.给予稳转H9c2心肌细胞Omi/HtrA2的特异性抑制剂ucf-101后，自噬水平下降;给予自噬阻断剂3-MA后，稳转H9c2心肌细胞自噬水平显著下降 Westernblot结果显示:与稳转H9c2心肌细胞相比，给予ucf-101抑制Omi/HtrA2后，LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均显著下降(P＜0.05;图15A-B);给予自噬阻断剂3-MA后，H9c2心肌细胞LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均无显著变化，稳转H9c2心肌细胞LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均显著下降(P＜0.05;图15C-D); 3.3.稳转H9c2心肌细胞存活率显著高于H9c2心肌细胞;给予自噬阻断剂3-MA后，H9c2心肌细胞存活率无显著变化，稳转H9c2心肌细胞存活率显著升高 cck8结果显示:与H9c2心肌细胞相比，稳转H9c2心肌细胞存活率显著升高;给予自噬阻断剂3-MA后，H9c2心肌细胞存活率无显著变化，而稳转H9c2心肌细胞存活率显著升高（P＜0.05;图16）; 3.4.稳转H9c2心肌细胞衰老情况增加 β-半乳糖苷酶染色结果显示:与H9c2心肌细胞相比，慢病毒稳转H9c2心肌细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高(P＜0.05;图17)。 结论: 衰老心肌细胞中表达增加的Omi/HtrA2，促进了心肌细胞的自噬，增加了心肌细胞的衰老。