衰老心肌中增加的Omi/HtrA2可以促进心肌细胞自噬

来源 :首都医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fly19791013fly
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景:  衰老是机体一系列生理及病理变化的过程,而心脏的衰老是心血管系统及其他器官变化的集中体现。生理情况下,心脏存在低水平的自噬,用于维持正常的心脏结构和功能。而在很多病理情况下,则有明显的自噬活动的增加。过多的自噬导致心肌细胞发生自噬性细胞死亡,加重心脏的损伤;而抑制心肌细胞自噬,则可以明显改善衰老心脏功能。研究表明,在胚胎成纤维细胞中线粒体促凋亡蛋白Omi/HtrA2能够促进自噬的发生。我们的前期研究发现,衰老大鼠心肌组织中Omi/HtrA2蛋白表达增加,那么衰老心肌中增多的Omi/HtrA2是否也可参与了衰老心肌细胞自噬?对这一问题的研究,将有助于探讨衰老心肌中增加的Omi/HtrA2与心肌细胞自噬的关系,为Omi/HtrA2作为调节心肌细胞自噬提供实验依据。  研究目的:  利用D-半乳糖干预胎鼠心肌细胞系H9c2建立衰老细胞模型使Omi/HtrA2表达增加,利用慢病毒稳转H9c2心肌细胞系过表达Omi/HtrA2,观察心肌细胞自噬水平,探讨衰老心肌细胞中增加的Omi/HtrA2在心肌细胞自噬中的作用。  实验方法:  1、细胞培养及处理:选用22-28代细胞用于实验,将H9c2心肌细胞消化后得到的单细胞悬液,调节细胞密度至(5-6)×105个/ml后,接种于6孔板中。实验分组如下:(1)H9c2心肌细胞Omi/HtrA2过表达组:利用慢病毒载体转染使H9c2心肌细胞过表达Omi/HtrA2;(2)D-半乳糖干预衰老组:D-半乳糖(8g/L)诱导H9c2心肌细胞衰老组;(3)ucf-101组:10-5mol/Lucf-101作用组;(4)H9c2心肌细胞对照组。8g/LD-半乳糖诱导H9c2衰老实验处理时间为5天,10-5mol/Lucf-101作用于细胞时间为72h,各处理组n值均为6,检验各项指标。  2、检测指标:(1)细胞衰老情况:光学显微镜下观察β-半乳糖苷酶染色情况;(2)细胞存活率:CCK8染色试剂盒检测法;(3)细胞损伤情况:比色法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;(4)Gateway载体构建技术构建各质粒;(5)Westernblot法检测Omi/HtrA2蛋白及自噬相关蛋白LC-3Ⅱ、beclin1的表达。  实验结果:  1.H9c2心肌细胞衰老模型建立  1.1.H9c2心肌细胞衰老模型构建及鉴定  D-半乳糖的不同浓度(0、5、8、10、12g/L)及不同作用时间(3、5、7、10天)对H9c2心肌存活率的影响(P<0.01;图1)。统计学分析后选择8g/L的浓度作用5天作为D-gal干预H9c2心肌细胞的条件。各组细胞分别进行β-半乳糖苷酶染色,结果显示:与H9c2心肌细胞对照组比较,D-半乳糖干预衰老组β-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高(P<0.01;图3)。  1.2.D-半乳糖对H9c2心肌细胞存活率和LDH活性的影响  CCK8和LDH检测结果显示:与H9c2心肌细胞对照组比较,D-半乳糖干预下衰老组细胞存活率显著升高,LDH活性显著升高(P<0.01;图4)。  1.3.衰老H9c2心肌细胞Omi/HtrA2蛋白表达增加  Westernblot结果显示:与H9c2心肌细胞对照组比较,D-半乳糖干预衰老组细胞Omi/HtrA2蛋白表达显著增加(P<0.05;图5)。  以上结果提示,衰老心肌细胞模型构建成功。  2.质粒构建及细胞转染  2.1.质粒pDown-HtrA2的测序鉴定:  pDown-HtrA2质粒直接进行测序,结果显示,pDown-HtrA2质粒的序列全长为1627bp,表明质粒pDown-HtrA2构建成功(图6;表1)。  2.2.重组质粒HtrA2的鉴定:  HtrA2质粒直接进行测序,结果显示,HtrA2质粒的序列全长为834bp,表明质粒HtrA2构建成功(图7;表2)。  2.3.重组慢病毒pLV.EX3d.P-neo-EF1A-HtrA2-IRES-eGFP的包装:  镜下结果显示:pLV.EX3d.P-neo-EF1A-HtrA2-IRES-eGFP病毒成功包装(图8A-B);  pLV.EX2d.P-neo-EF1A-eGFP病毒包装成功(图9A-B)。  2.4.病毒滴度的测定  镜下计数结果显示:Lenti-neo-EF1A-HtrA2-IRES-eGFP/Neo滴度为4.7×107,Lenti-neo-EF1A-eGFP/Neo滴度5.0×107。  2.5.慢病毒转染H9c2心肌细胞转导率  显微镜下结果显示:H9c2/EGFP-neo转导率达90%(图10A-B),H9c2/HtrA2-EGFP-neo转导率为60%-70%(图11A-B)。  2.6.慢病毒成功转染H9c2心肌细胞  Q-PCR结果显示:H9c2心肌细胞目的基因2-△△CT是100.00%,带有绿色荧光蛋白(eGFP)的目的基因2-△△CT是102.65%,过表达Omi/HtrA2的H9c2心肌细胞目的基因2-△△CT是3728.43%;Q-PCR检测到H9c2/HtrA2心肌细胞中Omi/HtrA2基因过表达(表3;图12A-F);  Westernblot结果显示:与H9c2心肌细胞相比,H9c2/EGFP细胞中Omi/HtrA2蛋白无显著变化,H9c2/HtrA2心肌细胞Omi/HtrA2蛋白表达显著升高(P<0.05;表4;图13);  以上结果提示,慢病毒质粒构建及细胞转染成功。  3.稳转H9c2心肌细胞中Omi/HtrA2促进心肌细胞自噬  3.1.稳转H9c2心肌细胞中Omi/HtrA2过表达,自噬水平上升  Westernblot结果显示:与H9c2心肌细胞相比,慢病毒稳转H9c2细胞中LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均显著升高(P<0.05;图14);  3.2.给予稳转H9c2心肌细胞Omi/HtrA2的特异性抑制剂ucf-101后,自噬水平下降;给予自噬阻断剂3-MA后,稳转H9c2心肌细胞自噬水平显著下降  Westernblot结果显示:与稳转H9c2心肌细胞相比,给予ucf-101抑制Omi/HtrA2后,LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均显著下降(P<0.05;图15A-B);给予自噬阻断剂3-MA后,H9c2心肌细胞LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均无显著变化,稳转H9c2心肌细胞LC3-Ⅱ和beclin1蛋白水平均显著下降(P<0.05;图15C-D);  3.3.稳转H9c2心肌细胞存活率显著高于H9c2心肌细胞;给予自噬阻断剂3-MA后,H9c2心肌细胞存活率无显著变化,稳转H9c2心肌细胞存活率显著升高  cck8结果显示:与H9c2心肌细胞相比,稳转H9c2心肌细胞存活率显著升高;给予自噬阻断剂3-MA后,H9c2心肌细胞存活率无显著变化,而稳转H9c2心肌细胞存活率显著升高(P<0.05;图16);  3.4.稳转H9c2心肌细胞衰老情况增加  β-半乳糖苷酶染色结果显示:与H9c2心肌细胞相比,慢病毒稳转H9c2心肌细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高(P<0.05;图17)。  结论:  衰老心肌细胞中表达增加的Omi/HtrA2,促进了心肌细胞的自噬,增加了心肌细胞的衰老。
其他文献
核因子kappa B(NFκB)是一种重要的转录因子.在外界刺激引起中枢神经系统内相关基因表达的过程当中起着重要的作用。趋化因子Fractalkine(FKN)及其特异性受体CX3CR1与神经元
机器视觉检测是信息处理的重要研究方向之一。本文针对药用管制玻璃瓶检测的特点,利用基于机器视觉的图像技术研制了一套检测管制玻璃瓶缺陷的系统,制定了系统的总体设计方案
电磁超材料(Electromagnetic Metamaterial,EMM)是一类通过特殊的结构设计而具有负介电常数或负磁导率的人工复合材料。近年来,国内外学者对电磁超材料做了诸多研究,实现了电
能源节约和环境保护问题已经是当今全世界普遍关注的两大问题。而太阳电池作为一种节能环保装置,是利用太阳能产生光伏效应的一种光电转换器件,有着广阔的发展前景。硫化锡(SnS),以其安全无毒、资源丰富、转换效率高等优点,已经成为受到国内外研究者极大关注的一种新型太阳电池材料。SnS的直接禁带宽度Eg为1.3~1.5eV,接近太阳能电池的最佳禁带宽度;在理论上其能量转换效率达到25%;吸收系数α>104c
随着商业计算和金融分析等高精度计算应用领域的高速发展,提供硬件支持十进制算术运算变得越来越重要,新的IEEE 754-2008浮点运算标准也添加了十进制算术运算规范。采用硬件
脊椎动物中枢神经系统发育是一个复杂、有序、严谨的过程,受到一些细胞外信号分子如BMP、FGF、Wnt和细胞内表观遗传(Epigenetic)网络的共同调控。其中microRNAs发挥着重要作用
低温共烧陶瓷(LTCC)技术广泛应用于射频与微波无源集成模块的制作,LTCC技术的多层介质结构非常有利于射频与微波无源电路集成化与小型化的实现。因此,相关产品广泛应用于GSM、W
在移动通信系统,MIMO技术是指利用多发射天线和多接收天线进行无线传输的技术,它充分利用了无线传播环境中丰富的多径特性。目前,无线MIMO技术已经被认为是未来高速宽带无线Inte
高等植物中的HKT(High-affinity K Transporter)蛋白最早于小麦中被发现,因其在酵母中具有高亲和吸收K+的活性而得名。HKT蛋白在高等植物中广泛存在,可以分为两个亚家族。已有
全光波长变换器作为光交换网络中一个核心交换器件,是当前研究的一个热点,利用光纤的非线性效应实现的全光波长变换具有高速的特点,而利用孤子自频移这种非线性效应还具有依