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目的:长链非编码RNA HOTAIR在卵巢癌中表达异常升高,且与卵巢癌患者较短的生存期相关。本课题拟明确HOTAIR在上皮性卵巢癌紫杉醇耐药中的作用,并探讨HOTAIR通过调控细胞周期检查点激酶CHEK1促进卵巢癌紫杉醇耐药的机制。方法:1.不同浓度紫杉醇处理卵巢癌细胞系SKOV3、ES2、A2780和CAOV3,并设置24h、48h、72h三个时间梯度,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测HOTAIR的表达变化;2.应用携带sh RNA与过表达HOTAIR质粒的慢病毒,建立稳定下调HOTAIR的卵巢癌细胞株SKOV3sh HOTAIR和稳定上调HOTAIR的卵巢癌细胞株ES2lv-HOTAIR,q RT-PCR验证HOTAIR上调和下调效率,进行克隆形成实验、MTT实验、Ed U实验、流式-细胞周期检测实验以检测HOTAIR对细胞耐药性、增殖能力与细胞周期的影响,并用q RT-PCR和免疫印迹(WB)检测CHEK1的m RNA与蛋白表达水平以及P-糖蛋白(P-gp)的蛋白水平;3.在SKOV3sh HOTAIR细胞中采用过表达质粒瞬时上调CHEK1,WB验证CHEK1蛋白水平上调效果,MTT实验检测上调CHEK1后SKOV3sh HOTAIR细胞紫衫醇耐药性的恢复情况;4.用SKOV3sh HOTAIR和SKOV3sh NC细胞建立皮下移植瘤模型,成瘤后各自随机分为两组,每组6只,每三天一次分别予以溶剂对照(control)或紫杉醇腹腔注射,总计给药5次,监测老鼠体重和肿瘤体积;免疫组织化学检测以上四组移植瘤中CHEK1、p-CHEK1、Ki-67表达水平;结果:1.紫杉醇处理卵巢癌细胞系后HOTAIR表达升高。用紫杉醇处理的四个卵巢癌细胞系HOTAIR表达水平均显著增高(与对照组DMSO相比,分别升高29.31±1.06倍至94.34±6.16倍不等),但未观察到明显的时间与剂量依赖性。各卵巢癌细胞系中HOTAIR升高最显著的紫杉醇处理条件如下:SKOV3,0.1μM,48小时;ES2,0.4μM 24小时;A2780,0.4μM,48小时;CAOV3,0.1μM,48小时。作为后续细胞实验给药方案。2.HOTAIR促进卵巢癌细胞对紫杉醇耐药。1)建立稳定上调和下调HOTAIR的卵巢癌细胞:与ES2lv-NC相比,ES2lv-HOTAIR中HOTAIR表达升高了14.30±1.96倍;与SKOV3sh NC相比,SKOV3sh HOTAIR中HOTAIR表达下调了(74.77±4.16)%;2)HOTAIR影响紫杉醇对卵巢癌的细胞毒性:MTT结果显示ES2lv-HOTAIR细胞耐药性显著高于ES2lv-NC(IC50值:15.95±1.19 n M vs.7.65±2.48 n M);SKOV3sh HOTAIR细胞耐药性显著低于SKOV3sh NC(IC50值:9.81±3.75 n M vs.18.20±6.24 n M);3)HOTAIR促进卵巢癌对紫杉醇产生化疗抵抗:用不同浓度紫杉醇处理后,相比于ES2lv-NC,ES2lv-HOTAIR的克隆形成能力显著增强;相比于SKOV3sh NC,SKOV3sh HOTAIR克隆形成能力显著减弱;4)下调HOTAIR促进紫杉醇对卵巢癌细胞增殖抑制的作用:Ed U结果显示,用紫杉醇处理后,ES2lv-HOTAIR细胞增殖率约为ES2lv-NC细胞的1.75倍;而SKOV3sh HOTAIR细胞的增殖能力约为SKOV3sh NC细胞的37%;5)下调HOTAIR促进紫杉醇对卵巢癌细胞的周期阻滞作用。SKOV3sh HOTAIR细胞中,紫杉醇形成的G2/M期周期阻滞比例高于SKOV3sh NC(G2/M期比例:(52.23±3.47)%vs(73.37±1.10)%,p<0.01)。3.HOTAIR通过调控CHEK1蛋白水平促进卵巢癌紫杉醇耐药。1)WB结果显示ES2lv-HOTAIR细胞中CHEK1蛋白表达增加,而SKOV3sh HOTAIR细胞中CHEK1蛋白表达减少,但是在两组细胞中,q RT-PCR均为检测到CHEK1 m RNA水平的明显变化;各组间P-g P表达差异不显著;2)在SKOV3sh HOTAIR细胞中上调CHEK1,细胞对紫杉醇的耐药性部分恢复。转染CHEK1对照质粒的细胞中,SKOV3sh HOTAIR的IC50值显著低于SKOV3sh NC(4.18±0.90 n M vs.25.56±1.60 n M);在上调CHEK1的细胞中,SKOV3sh HOTAIR的耐药性得到恢复,但其IC50值仍低于相同处理的SKOV3sh NC细胞(13.64±0.96 n M vs.37.72±4.08 n M)。4.动物实验体内验证HOTAIR促进卵巢癌对紫杉醇耐药1)与SKOV3sh NC相比,紫杉醇对SKOV3sh HOTAIR移植瘤的抑制作用显著增强;2)无论是溶剂对照还是紫杉醇处理的动物中,SKOV3sh HOTAIR组的肿瘤生长速度显著慢于SKOV3sh NC组;3)无论是溶剂对照还是紫杉醇处理的动物中,SKOV3sh HOTAIR组的肿瘤CHEK1、p-CHEK1、Ki-67表达显著低于SKOV3sh NC组。结论:在上皮性卵巢癌中,HOTAIR通过上调CHEK1表达促进细胞周期进展参与紫杉醇耐药机制。