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颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是我国最为常见的难治性癫痫，属于典型的慢性神经系统疾病。患者病灶区谷氨酸能神经元（Glutamate Neurons）会出现反复的异常同步性放电，经过多次反复的异常放电后使神经元发生不可逆的损伤直至死亡。由于目前还没有有效治疗颞叶癫痫的药物和手段，患者病情普遍逐渐加重，病灶区大量神经细胞死亡，主要包括铁死亡、自噬、细胞凋亡和坏死等多种形式。匹鲁卡品（Pilocarpine）是一种既亲水又亲脂的非选择性毒蕈碱型乙酰胆碱受体 1（mAChR1）的激动剂，分子量小，可快速透过由生物膜构成的屏障，诱导细胞发生明显的去极化。用匹鲁卡品构建的动物颞叶癫痫模型是目前国际公认的造模方式之一，能够很好的模拟人类颞叶癫痫的病理学和行为学特点。
虽然目前的研究成果较为详细的揭示了各种细胞死亡方式的机制，但是在大脑如此复杂而精密的结构中，颞叶癫痫病灶区中哪种细胞死亡形式是最先响应的，它与其他细胞死亡方式是否相互影响，对于这些问题的研究还没有相关的报道。
为了避免大脑中复杂的相互作用带来的影响，本研究选择通过匹鲁卡品体外处理Neuro-2a、BV2和U251三种细胞系，通过控制处理时间和处理浓度检测不同细胞发生铁死亡（Ferroptosis）、自噬（Autophagy）、细胞凋亡（Apoptosis）和坏死（Necrosis）的先后顺序及可能存在的相互影响。探究匹鲁卡品诱导Neuro-2a细胞发生的细胞死亡方式及不同死亡形式间的相互影响。比较BV2和U251间存在的死亡方式的差异。研究结果主要分为以下两部分：
第一部分：匹鲁卡品诱导Neuro-2a细胞发生的细胞死亡方式及不同死亡形式间的相互影响。
1.通过Western blot确定Neuro-2a表达mAChR1。
2.通过MTT检测匹鲁卡品处理后的细胞活力曲线，确定3.125 g/L和6.25 g/L处理6 h；3.125 g/L处理6 h，12 h和24 h两种处理方式。
3.检测短时间处理后细胞各种死亡方式标志蛋白水平。与 control 组比，NCOA4， LC3b，RIP1表达量均明显上调，表明发生了自噬和铁蛋白自噬。
4.通过LIP和ICP-MS检测两处理组胞内的自由铁池水平和总铁水平。与control组比，两种处理浓度下的自由铁池水平均明显下调，胞内总铁水平上调。
5.检测两处理组铁代谢相关蛋白水平。与 control 组比，IRP2、TfR1 蛋白水平均下调，FtL蛋白水平上调，DMT1+IRE在6.25 g/L处理组表达下调。即除FtH外均受到IRP2调控。
6.延长处理时间后检测3.125 g/L匹鲁卡品处理后各种死亡形式标志蛋白水平。与0 h相比，GPX4在12 h和24 h开始明显下调，COX-2在24 h时表达下调，ACSL4表达无明显变化；LC3b在6 h时表达上调且随着处理时间的延长表达上调越加显著，NCOA4在6 h时表达上调后12 h表达下调，24 h时与0 h时比无明显差异。表明细胞发生了铁死亡，自噬和铁蛋白自噬仍在发生。
7.通过LIP检测处理后细胞内的自由铁池水平。与0 h比，6 h时自由铁池水平下调， 12 h时无明显差异，24 h时明显上调。
8.检测处理后铁代谢相关蛋白水平。与 control 组比，IRP2，TfR1，DMT1+IRE 蛋白水平在不同时间点均明显下调；FtL在6 h时表达上调，在12 h和24 h时无明显变化；FtH在12 h和24 h时极显著下调。
9.通过MTT筛选自噬抑制剂3-MA的合适处理浓度。3-MA处理浓度不大于40μM时处理细胞24 h，细胞活性不受影响。
10.通过免疫荧光双标LAMP1和FtH，检测自噬抑制剂3-MA存在条件下铁蛋白自噬水平。发现3-MA有效缓解了匹鲁卡品引起的FtH降解。
11.通过MTT检测，与Pilo处理组比，3-MA与Pilo联合处理后Neuro-2a的细胞活力明显上调。
12.检测处理后TNF-α、IL-6和IL-1β的转录水平变化。与0 h相比，TNF-α和IL-6在6h时极显著下调，而后随着时间延长有上调趋势但不及0h组；IL-1β在6h时明显上调，12 h和24 h有下调趋势，但均明显高于0 h。
第二部分：匹鲁卡品能够诱导BV2和U251发生细胞死亡且主要死亡形式不同。
1.通过Western blot确定BV2和U251细胞均表达mAChR1。
2.通过MTT检测匹鲁卡品处理不同时间不同浓度后BV2和U251的细胞活力曲线。发现BV2对匹鲁卡品的处理更加敏感。
3.检测两处理组BV2和U251坏死标志蛋白水平。与control组比，BV2的RIP1在6.25 g/L组表达下调；U251的RIP1和RIP3均表达上调。表明U251的坏死被激活，而BV2并不明显。
4.检测两处理组 BV2 和 U251 细胞凋亡标志蛋白水平。与 control 组比，BV2 的Bax/Bcl2在6.25 g/L组表达上调，活化的Caspase-3明显上调；U251的Bax/Bcl2在3.125 g/L组表达上调而活化的Caspase-3无明显变化。表明BV2的细胞凋亡被激活，而U251不明显。
5.检测BV2和U251细胞铁死亡标志蛋白的蛋白水平。与control组比，BV2的ACSL4在3.125 g/L组表达上调，COX-2在6.25 g/L组表达下调；U251的GPX4表达上调，COX-2在6.25 g/L组表达上调。表明铁死亡并没有发生，但一些通路开始响应，且两中细胞不同。
6.通过LIP和ICP-MS检测两处理组BV2和U251细胞内的自由铁池水平和总铁水平。与control组比，BV2的自由铁池水平均明显上调，胞内总铁水平下调；U251的自由铁池水平在6.25 g/L组上调，胞内总铁水平无明显变化。
7.检测两处理组BV2和U251细胞铁代谢相关蛋白水平。与control组比，两种细胞的IRP1、IRP2和DMT1+IRE均在6.25 g/L组下调；TfR1在两个处理组均表达下调；BV2的FtH明显下调；U251的FPN1、FtH和FtL在6.25 g/L组下调。表明铁蛋白变化没有按照IRP-IRE调控上调。
8.检测两处理组BV2和U251铁蛋白自噬标志蛋白NCOA4水平。与control组比， BV2和U251的两个处理组均表达下调。表明NCOA4被消耗了。
由以上结果得出结论：匹鲁卡品诱导Neuro-2a细胞迅速发生强烈的自噬，并且自噬依赖性铁蛋白降解被迅速激活，使得胞内自由铁池水平升高，同时也导致了细胞进出铁紊乱，胞内总铁水平上升，两者引发了二价铁离子诱导的铁死亡的发生。匹鲁卡品诱导BV2细胞凋亡快速激活，对匹鲁卡品的刺激比U251敏感。匹鲁卡品诱导U251坏死途径快速激活，这或许和其本身含铁量和摄铁量较少有关。本研究阐述了构建经典颞叶癫痫模型的药物匹鲁卡品诱导 Neuro-2a 细胞发生铁死亡的过程，也阐述了 BV2 和 U251经匹鲁卡品处理后被快速激活的细胞死亡形式的差异，这或许可以为今后探寻治疗颞叶癫痫方法提供一些新的思路。
虽然目前的研究成果较为详细的揭示了各种细胞死亡方式的机制，但是在大脑如此复杂而精密的结构中，颞叶癫痫病灶区中哪种细胞死亡形式是最先响应的，它与其他细胞死亡方式是否相互影响，对于这些问题的研究还没有相关的报道。
为了避免大脑中复杂的相互作用带来的影响，本研究选择通过匹鲁卡品体外处理Neuro-2a、BV2和U251三种细胞系，通过控制处理时间和处理浓度检测不同细胞发生铁死亡（Ferroptosis）、自噬（Autophagy）、细胞凋亡（Apoptosis）和坏死（Necrosis）的先后顺序及可能存在的相互影响。探究匹鲁卡品诱导Neuro-2a细胞发生的细胞死亡方式及不同死亡形式间的相互影响。比较BV2和U251间存在的死亡方式的差异。研究结果主要分为以下两部分：
第一部分：匹鲁卡品诱导Neuro-2a细胞发生的细胞死亡方式及不同死亡形式间的相互影响。
1.通过Western blot确定Neuro-2a表达mAChR1。
2.通过MTT检测匹鲁卡品处理后的细胞活力曲线，确定3.125 g/L和6.25 g/L处理6 h；3.125 g/L处理6 h，12 h和24 h两种处理方式。
3.检测短时间处理后细胞各种死亡方式标志蛋白水平。与 control 组比，NCOA4， LC3b，RIP1表达量均明显上调，表明发生了自噬和铁蛋白自噬。
4.通过LIP和ICP-MS检测两处理组胞内的自由铁池水平和总铁水平。与control组比，两种处理浓度下的自由铁池水平均明显下调，胞内总铁水平上调。
5.检测两处理组铁代谢相关蛋白水平。与 control 组比，IRP2、TfR1 蛋白水平均下调，FtL蛋白水平上调，DMT1+IRE在6.25 g/L处理组表达下调。即除FtH外均受到IRP2调控。
6.延长处理时间后检测3.125 g/L匹鲁卡品处理后各种死亡形式标志蛋白水平。与0 h相比，GPX4在12 h和24 h开始明显下调，COX-2在24 h时表达下调，ACSL4表达无明显变化；LC3b在6 h时表达上调且随着处理时间的延长表达上调越加显著，NCOA4在6 h时表达上调后12 h表达下调，24 h时与0 h时比无明显差异。表明细胞发生了铁死亡，自噬和铁蛋白自噬仍在发生。
7.通过LIP检测处理后细胞内的自由铁池水平。与0 h比，6 h时自由铁池水平下调， 12 h时无明显差异，24 h时明显上调。
8.检测处理后铁代谢相关蛋白水平。与 control 组比，IRP2，TfR1，DMT1+IRE 蛋白水平在不同时间点均明显下调；FtL在6 h时表达上调，在12 h和24 h时无明显变化；FtH在12 h和24 h时极显著下调。
9.通过MTT筛选自噬抑制剂3-MA的合适处理浓度。3-MA处理浓度不大于40μM时处理细胞24 h，细胞活性不受影响。
10.通过免疫荧光双标LAMP1和FtH，检测自噬抑制剂3-MA存在条件下铁蛋白自噬水平。发现3-MA有效缓解了匹鲁卡品引起的FtH降解。
11.通过MTT检测，与Pilo处理组比，3-MA与Pilo联合处理后Neuro-2a的细胞活力明显上调。
12.检测处理后TNF-α、IL-6和IL-1β的转录水平变化。与0 h相比，TNF-α和IL-6在6h时极显著下调，而后随着时间延长有上调趋势但不及0h组；IL-1β在6h时明显上调，12 h和24 h有下调趋势，但均明显高于0 h。
第二部分：匹鲁卡品能够诱导BV2和U251发生细胞死亡且主要死亡形式不同。
1.通过Western blot确定BV2和U251细胞均表达mAChR1。
2.通过MTT检测匹鲁卡品处理不同时间不同浓度后BV2和U251的细胞活力曲线。发现BV2对匹鲁卡品的处理更加敏感。
3.检测两处理组BV2和U251坏死标志蛋白水平。与control组比，BV2的RIP1在6.25 g/L组表达下调；U251的RIP1和RIP3均表达上调。表明U251的坏死被激活，而BV2并不明显。
4.检测两处理组 BV2 和 U251 细胞凋亡标志蛋白水平。与 control 组比，BV2 的Bax/Bcl2在6.25 g/L组表达上调，活化的Caspase-3明显上调；U251的Bax/Bcl2在3.125 g/L组表达上调而活化的Caspase-3无明显变化。表明BV2的细胞凋亡被激活，而U251不明显。
5.检测BV2和U251细胞铁死亡标志蛋白的蛋白水平。与control组比，BV2的ACSL4在3.125 g/L组表达上调，COX-2在6.25 g/L组表达下调；U251的GPX4表达上调，COX-2在6.25 g/L组表达上调。表明铁死亡并没有发生，但一些通路开始响应，且两中细胞不同。
6.通过LIP和ICP-MS检测两处理组BV2和U251细胞内的自由铁池水平和总铁水平。与control组比，BV2的自由铁池水平均明显上调，胞内总铁水平下调；U251的自由铁池水平在6.25 g/L组上调，胞内总铁水平无明显变化。
7.检测两处理组BV2和U251细胞铁代谢相关蛋白水平。与control组比，两种细胞的IRP1、IRP2和DMT1+IRE均在6.25 g/L组下调；TfR1在两个处理组均表达下调；BV2的FtH明显下调；U251的FPN1、FtH和FtL在6.25 g/L组下调。表明铁蛋白变化没有按照IRP-IRE调控上调。
8.检测两处理组BV2和U251铁蛋白自噬标志蛋白NCOA4水平。与control组比， BV2和U251的两个处理组均表达下调。表明NCOA4被消耗了。
由以上结果得出结论：匹鲁卡品诱导Neuro-2a细胞迅速发生强烈的自噬，并且自噬依赖性铁蛋白降解被迅速激活，使得胞内自由铁池水平升高，同时也导致了细胞进出铁紊乱，胞内总铁水平上升，两者引发了二价铁离子诱导的铁死亡的发生。匹鲁卡品诱导BV2细胞凋亡快速激活，对匹鲁卡品的刺激比U251敏感。匹鲁卡品诱导U251坏死途径快速激活，这或许和其本身含铁量和摄铁量较少有关。本研究阐述了构建经典颞叶癫痫模型的药物匹鲁卡品诱导 Neuro-2a 细胞发生铁死亡的过程，也阐述了 BV2 和 U251经匹鲁卡品处理后被快速激活的细胞死亡形式的差异，这或许可以为今后探寻治疗颞叶癫痫方法提供一些新的思路。