【摘 要】
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怀牛膝（Achyranthes bidentata Blume）是苋科牛膝属双子叶草本植物,以干燥根入药,具有多种药用成分,是河南省著名的“四大怀药”之一。其中齐墩果酸型三萜皂苷（Oleanolic acid triterpene saponins）和蜕皮甾酮（Ecdysterone）是怀牛膝中的主要活性成分,其主要代谢途径为甲羟戊酸途径（Mevalonate Pathway,MVA）,受多种酶基
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怀牛膝（Achyranthes bidentata Blume）是苋科牛膝属双子叶草本植物,以干燥根入药,具有多种药用成分,是河南省著名的“四大怀药”之一。其中齐墩果酸型三萜皂苷（Oleanolic acid triterpene saponins）和蜕皮甾酮（Ecdysterone）是怀牛膝中的主要活性成分,其主要代谢途径为甲羟戊酸途径（Mevalonate Pathway,MVA）,受多种酶基因的调控,例如鲨烯合酶（squalene synthase,SS）、β-香树脂合成酶（β-amyrin synthase,β-AS）和环阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase,CAS）。为了提高牛膝中主要药用成分的含量,通过分子生物学手段研究牛膝MVA途径中的AbSS基因的功能,以期提高牛膝中主要药用成分的含量。本课题组通过无缝克隆的方法构建了AbSS过表达载体,通过农杆菌侵染法将过表达载体分别转入模式植物拟南芥和牛膝组织中,q RT-PCR法测定转基因拟南芥和牛膝组织中的AbSS表达量,HPLC法检测转基因株系中的齐墩果酸和蜕皮甾酮含量的变化;同时本课题组还研究了在牛膝中过表达AbCAS对齐墩果酸和蜕皮甾酮含量的影响。主要研究结果如下:1.使用无缝克隆技术,成功的获得pART-CAM-SS与pCAM35s-GFP-SS重组质粒。2.将植物亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-SS瞬时转化烟草表皮细胞,发现怀牛膝SS蛋白主要定位于烟草表皮细胞的细胞质和细胞核核膜。3.使用花序浸染法将过表达载体pART-CAM-SS转入拟南芥中,通过培养、筛选及PCR验证,获得T3代纯合阳性转基因拟南芥植株。选取2、3、8和12号拟南芥进行研究。与对照组相比,转基因拟南芥植株更加健壮,转AbSS基因拟南芥的鲜重、干重、株高显著高于对照组。q RT-PCR检测发现各组织中的At SS基因显著增高,尤其在根、花和果荚中表达量均极显著增高;此外,转基因拟南芥MVA途径中相关酶基因At HMGR1、At FPS、At SE、Atβ-AS和At CAS表达量也均有显著提高。转基因拟南芥2、3和12中齐墩果酸含量分别增加了2.05、1.45、和2.17倍,2、3、8和12蜕皮甾酮含量分别增加了1.22、1.34、0.76和0.57倍。4.将AbSS过表达载体转入牛膝叶片中,通过诱导培养获得愈伤细胞,经筛选以及PCR验证,获得了转基因阳性愈伤细胞,选取SS-1、SS-3、SS-4和SS-7 4株细胞分裂速度较快、长势较好的AbSS阳性细胞系,作为继续培养研究的材料。通过q RT-PCR法检测SS-1、SS-3、SS-4和SS-7阳性愈伤细胞中AbSS以及MVA途径中Ab HMGS、Ab HMGR、Ab FPS和Ab SE、Abβ-AS和AbCAS基因表达量。与对照组相比,AbSS表达量和相关酶基因表达量也显著增高,测定转AbSS牛膝愈伤细胞中的齐墩果酸和蜕皮甾酮的含量,SS-1、SS-3、SS-4和SS-7愈伤细胞中齐墩果酸含量分别是对照的1.56、1.81、2.48和1.96倍,蜕皮甾酮含量分别是对照1.79、1.61、1.44和1.51倍。5.将AbCAS转入牛膝中,获得4个长势较好的阳性细胞系,分别为CAS-1、CAS-5、CAS-7和CAS-9。与对照组相比,转基因组中AbCAS以及上游基因的表达量显著升高,分别增加了450.49%、387.32%、376.23%和7700.7%。转AbCAS牛膝愈伤细胞中,CAS-1、CAS-5、CAS-7和CAS-9的蜕皮甾酮含量均比与对照显著增加,而齐墩果酸的含量均显著下降。其中T-1中蜕皮甾酮含量最高,达到0.46 mg/g,是对照组的2.47倍,而CAS-5中齐墩果酸含量最低,与对照组相比下降了118.38%。根据以上结果分析,本研究主要得到如下结论:1.亚细胞定位研究表明,牛膝SS蛋白主要存在于烟草表皮细胞的细胞质和细胞核核膜。2.获得了过表达AbSS拟南芥和牛膝愈伤细胞系,并且二者转基因株系中的AbSS基因表达量显著升高。3.转AbSS拟南芥的株高、鲜重、干重和光合素含量显著增加,说明AbSS对植物的生长发育具有促进作用。4.转AbSS拟南芥和牛膝愈伤细胞系齐墩果酸和蜕皮甾酮显著增加,表明AbSS在三萜皂苷和植物甾醇过程中具有关键作用。5.获得了过表达AbCAS牛膝愈伤细胞系,转基因细胞中的AbCAS表达量和蜕皮甾酮含量显著增加,而齐墩果酸的含量显著降低,证明AbCAS基因具有调控植物甾醇合成的作用,并且能抑制2,3-氧化鲨烯流向三萜皂苷合成途径。
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