【摘 要】
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近年来,随着人们物质生活水平的提高和生活节奏的加快,肿瘤的发病率和死亡率也呈现逐年上升的态势,这严重威胁着人们的生命与健康。在现代医学中,作为常用医疗手段的手术、放疗和化疗都因存在着毒副作用或肿瘤复发等原因而限制了其临床的使用。人类在分子生物学领域的深入研究,使得人们发现肿瘤的本质是基因的变异在细胞层次上的过度表达,这给予了研究人员通过导入外源正常基因修复或抑制异变基因从而从根源上完全治疗肿瘤的理
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近年来,随着人们物质生活水平的提高和生活节奏的加快,肿瘤的发病率和死亡率也呈现逐年上升的态势,这严重威胁着人们的生命与健康。在现代医学中,作为常用医疗手段的手术、放疗和化疗都因存在着毒副作用或肿瘤复发等原因而限制了其临床的使用。人类在分子生物学领域的深入研究,使得人们发现肿瘤的本质是基因的变异在细胞层次上的过度表达,这给予了研究人员通过导入外源正常基因修复或抑制异变基因从而从根源上完全治疗肿瘤的理论基础。但单一的外源基因由于其难以突破体内细胞内外环境的障碍而无法直接应用,因此必然需要一定的载体对其进行负载、保护与输送。纳米颗粒由于肿瘤组织的高通透性和滞留效应能在组织间富集,在基因输送中有着一定优势,但对于肿瘤间复杂的微环境,纳米载体在进入肿瘤细胞内时仍存在着诸多问题,例如无法被细胞内吞、难以逃离溶酶体、在细胞质内无法有效释放及难以入核转染表达等,都在一定程度上影响着纳米载体在基因治疗上的应用。针对这些问题,本论文在金纳米粒子的基础上通过外部化学改性,针对于肿瘤微环境细胞内外明显的pH差异设计出不同的pH响应性纳米基因载体,并引入核靶向性地塞米松、生物相容性壳聚糖等改善载体特性,克服载体在组织间的细胞摄入与在细胞内的释放、转染、表达等问题。具体工作主要包括以下两部分:（1）利用肿瘤组织间较低的pH与地塞米松增大核孔入核交流的靶向性,设计出pH响应性的2-氯丙烯酸氨乙酯改性的金-聚乙烯亚胺-2-氯丙烯酸氨乙酯-二甲基马来酸酐纳米粒子（Au-PEI-2-ClAEA-DMMA）和PEI与地塞米松偶联得到的PEI-Dexa。正电性的PEI-Dexa负载DNA与金纳米载体通过静电作用得到三元复合载体DNA/PEI-Dexa/Au-PEI-2-ClAEA-DMMA,在肿瘤组织间的酸性条件下外层载体Au-PEI-2-ClAEA-DMMA发生电荷翻转产生电荷排斥,DNA/PEI-Dexa解离出来通过内吞进入细胞质内,Dexa与核内信息分子结合靶向DNA入核表达。通过电位粒度仪检测了作为载体必需的粒径与表面电势,验证其在生理条件下的稳定性,并探究了最佳的质量复合比和在pH=6.0的条件下载体pH响应的电荷翻转能力。在凝胶电泳下验证了复合载体对DNA的负载能力,并在酸性条件下模拟肿瘤微环境载体的DNA负载与释放能力。细胞毒性实验证明了作为载体聚合物所必需的低毒性。细胞转染实验中共聚焦显微镜显示载体能很好的被细胞摄入转染,PEI-Dexa的引入相比于对照组能更好地促进DNA的入核转染,荧光蛋白在细胞核的分布更多。因此验证了PEI-Dexa/Au-PEI-2-ClAEA-DMMA载体设计的思路,具有基因的负载能力,并能在复杂环境下智能响应得到DNA体外释放的效果,在载体设计与应用上有一定潜力。（2）利用肿瘤组织间与肿瘤细胞内pH的梯度差异,设计出丙烯酸二甲基氨基乙酯改性的金纳米载体Au-PEI-DMAEA和降解羧化的壳聚糖（CCS）,金纳米载体带有正电与DNA复合,并在外层包裹生物相容性的壳聚糖得到三元复合载体DNA/Au-PEI-DMAEA/CCS。当纳米载体富集于细胞组织间时,外层壳聚糖在酸性条件下水解将内层载体裸露出来被细胞内吞;当进入肿瘤细胞内pH=7.4的弱碱性环境下两性分子DMAEA发生水解电荷排斥从而与DNA剥离,达到载体在梯度pH下二次响应释放DNA的目的。通过粒径仪与透射电镜探究载体的复合与稳定性,在Zeta电位下验证二者的电荷翻转性能。通过凝胶电泳实验探究载体对DNA的负载能力,并在pH为7.4-6.5-7.4这一梯度变化下模拟DNA的释放。细胞毒性实验验证了壳聚糖包裹下载体相比于对照组的低毒性,符合细胞摄入要求,转染实验中共聚焦显微镜下表现出远多于对照组的荧光蛋白,并在BCA实验下定量表现了载体的高转染效率。因此表明复合载体可以利用细胞内外的pH差异达到逐步响应释放的效果,为后续利用pH梯度治疗肿瘤提供了一定的潜力。
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