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目的：本研究立足肾脾相关理论,以肌注氢化可的松和灌胃大黄水煎液复制的肾脾阳虚大鼠模型为平台,观察模型大鼠的衰老变化,以肾脾阳虚对Klotho蛋白表达的影响为切入点,探讨Klotho蛋白及其调控的INS/IGF-1/PI3K/Akt信号转导通路与肾脾阳虚致衰的相关机制,并观察桂附理中丸对肾脾阳虚模型大鼠衰老指标的影响。运用现代研究手段检测其SOD活力、MDA含量,Klotho、Akt、Foxo3a三种基因mRNA及蛋白表达等衰老相关指标,旨在从Klotho蛋白表达调控细胞内的信号转导通路初步阐明肾脾阳虚致衰老的机理。方法：本课题采用8周龄SD大鼠40只,雄性,随机分为正常对照组、模型组、维生素E组和桂附理中丸组四组。除正常对照组外,其余各组大鼠均采用肌注氢化可的松和灌胃大黄水煎液复制肾脾阳虚大鼠模型。正常对照组大鼠每天上午8：00肌肉注射生理盐水1ml/200g体重,同时灌胃生理盐水2ml/200g体重,下午14：00灌胃生理盐水2ml/200g体重；其余组大鼠上午8：00肌肉注射氢化可的松1ml/200g体重(药物浓度为5mg/ml),同时灌胃大黄水煎液2ml/200g体重(药物浓度为0.4g/ml),下午14：00模型组灌胃生理盐水2ml/200g体重,维生素E组灌胃维生素E混悬液2m1/200g体重(药物浓度为0.0018g/ml),桂附理中丸组灌胃桂附理中丸混悬液2ml/200g体重(药物浓度为0.162g/ml),共30天。从造模结束次日起,所有实验大鼠取24小时尿液,腹主动脉采血后,再剥离大脑海马组织进行相关指标检测：①检测24小时尿17-OH-CS及血清睾酮(T)含量；②检测血清胃泌素、D—木糖含量；③观察海马组织的超微结构改变；④检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量；⑤取海马CA1区小块组织制备单细胞悬液,流式细胞仪检测大脑海马组织细胞周期,分析各时相区的百分率以明确细胞老化率；⑥实时荧光定量PCR检测信号转导通路(Klotho-INS/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中Klotho、Akt、Foxo3a三种衰老相关基因的mRNA表达；⑦蛋白免疫印迹及免疫组织化学法染色检测信号转导通路(Klotho-INS/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中Klotho、Akt、Foxo3a三种基因的蛋白表达。结果：①24小时尿液、血清指标检测：与正常对照组比较,模型组大鼠尿液17-OH-CS、血清T、胃泌素、D—木糖含量显著降低(P<0.01),SOD活力显著下降(P<0.01),血清MDA含量显著上升(P<0.01)；与模型组比较,维生素E组大鼠尿17-OH-CS、血清T、胃泌素、D—木糖含量及SOD活力均明显升高(P<0.05),血清MDA含量明显下降(P<0.05),桂附理中丸组大鼠血清T、胃泌素、D—木糖含量均显著升高(P<0.01),尿17-OH-CS、血清SOD活力明显升高(P<0.05),血清MDA含量明显下降(P<0.05)；与维生素E组比较,桂附理中丸组大鼠尿17-OH-CS、血清T、胃泌素、D—木糖含量明显升高(P<0.05),血清SOD活力明显升高(P<0.05)。②大脑海马组织指标检测：与正常对照组比较,模型组大脑海马细胞器减少,大量脂褐素沉积及海马神经元萎缩、细胞突触间隙加宽,细胞老化率明显上升；Klotho调控的细胞信号转导通路(Klotho-INS/IGF-1-PI3K-Akt-FOXO)中KlothomRNA表达水平明显降低(P<0.05),Foxo3amRNA表达水平明显升高(P<0.05),AktmRNA表达水平显著升高(P<0.01),Klotho阳性细胞的平均灰度值显著降低(P<0.01),P-Foxo3a阳性细胞的平均灰度值显著升高(P<0.01),P-Akt阳性细胞的平均灰度值明显升高(P<0.05)；与模型组比较,维生素E组及桂附理中丸组大脑海马细胞器增多,脂褐素沉积减少,较少见到海马神经元萎缩、细胞突触间隙加宽,细胞老化率明显下降,维生素E组大鼠KlothomRNA表达水平、平均灰度值明显升高(P<0.05), Akt、Foxo3amRNA表达水平,P-Akt、P-Foxo3a阳性细胞的平均灰度值均明显降低(P<0.05),桂附理中丸组大鼠KlothomRNA表达水平明显升高(P<0.05),Akt、Foxo3amRNA表达水平,P-Akt阳性细胞的平均灰度值均明显降低(P<0.05),Klotho阳性细胞的平均灰度值显著升高(P<0.01),P-Foxo3a阳性细胞的平均灰度值显著降低(P<0.01)；与维生素E组比较,桂附理中丸组大脑海马细胞器增多,很少见到脂褐素沉积减少,海马神经元萎缩、细胞突触间隙加宽,细胞老化率明显下降,Klotho阳性细胞的平均灰度值明显升高(P<0.05), AktmRNA的表达水平、P-Foxo3a阳性细胞的平均灰度值均明显降低(P<0.05)。结论：①采用肌注氢化可的松和灌胃大黄水煎液复合方法复制肾脾阳虚大鼠模型,模型大鼠的一般情况符合肾阳虚、脾阳虚证的诊断标准,且模型大鼠24小时尿17-OH-CS、血清T、血清胃泌素、D-木糖含量均显著下降,表明肾脾阳虚大鼠模型复制成功。②模型组大鼠海马cA1区细胞浆内细胞器较少,有大量脂褐素沉积,神经元细胞突触间隙加宽、神经元萎缩、水样变性等现象；血清SOD活力显著下降、MDA含量明显升高及细胞老化率上升,表明肾脾阳虚模型大鼠存在衰老变化。③温补肾脾方药—桂附理中丸可以激发机体抗衰老基因Klotho表达,促进FOXO的核迁移,直接调控并且上调SOD2的表达,增强抗氧化酶活力,修复机体受损组织器官,从而延缓肾脾阳虚导致衰老的进程。④肾脾阳虚模型大脑海马组织Klotho蛋白表达降低,对INS-IGF-1-PI3K-Akt信号级联的抑制减弱,信号转导通路下游Akt、 Foxo3a的磷酸化反应增强,磷酸化Akt、Foxo3a蛋白表达均增多,致使FOXO的核迁移减少,SOD2(MnSOD)的表达下调,超氧化物对机体的损伤增加,从而加速机体衰老。本研究首次采用肌注氢化可的松和灌胃大黄水煎液复合方法成功复制肾脾阳虚大鼠模型,温补肾脾方药——桂附理中丸可以延缓肾脾阳虚导致衰老的进程。肾脾阳虚模型大鼠由于其海马组织Klotho蛋白表达降低,进而使其下游的INS-IGF-1信号级联抑制减弱,信号转导通路下游Akt、Foxo3a的磷酸化反应增强,磷酸化Akt、Foxo3a蛋白表达增多,FOXO从细胞质移入细胞核减少,SOD2(MnSOD)的表达下调,超氧化物对机体的损害增加,从而加速机体衰老。由此可知,Klotho蛋白低表达是导致肾脾阳虚模型大鼠衰老的可能机制。