1.目的：　　作为黄药子中含量最高的二萜内酯类化合物，黄独素B(Diosbulbin B，DB)可作为抗肿瘤候选药物，在治疗肿瘤疾病的同时也引发严重的肝毒性。但其毒性机制还有待于进一步揭示。DB结构中含有两个内脂环和一个呋喃环，且DB主要通过CYP3A4代谢。文献表明呋喃环经CYP3A4代谢后可生成毒性物质2-丁烯-1，4-二醛，通过生成这种反应性代谢中间体，和体内的蛋白或亲核物质发生不可逆结合从而导致毒性。前期实验表明不同浓度DB对NIH3T3细胞不引起细胞毒性，其代谢产物在NIH3T3细胞上也无毒性作用。DB在大鼠原代肝细胞可产生毒性。加入酮康唑(KT)可显著抑制其毒性。那么在高表达CY3A4的细胞系中与正常组比较，DB的毒性是否会有差异？代谢活化过程是否是其致毒的主要机制？其毒性又是哪种物质导致的？　　基于前期研究发现，DB的抗肿瘤药效显著，在S180荷瘤小鼠的抑瘤率可达到41.7％(8 mg/mL)和57.9％(10 mg/mL)。但一些体外抗肿瘤试验中，DB却未显示明显的抗肿瘤活性。那么DB在体内与体外抗肿瘤作用为何相差如此之大？在大鼠体内药动学研究中，我们还发现DB经灌胃后，雄性和雌性的绝对生物利用度分别为0.3％和2.0％。不同性别存在差异性。由于DB的水溶性(100.94μg/mL)和脂溶性都不好(logP=0.34，pH=7.4)使得其很难被透过生物膜，影响体循环的吸收，所以其抗肿瘤活性被抑制;另外，由于DB的肝毒性作用，如何实现靶向给药，降低毒副作用，需要药剂学手段解决这些难题。　　综上所述，本课题以DB的抗肿瘤作用和细胞毒性为出发点，通过体外不同细胞模型的毒性研究，进一步解释DB的代谢活化所产生的毒性对细胞的影响，对DB致毒机理及物质做出合理的解释。并采用表面修饰的温敏性脂质体靶向给药系统，结合体外细胞摄取，体内吸收、分布等研究，目的在于提高其体内生物利用度，并解决所导致的严重肝毒性。以上内容对进一步揭示DB的毒性机制及指导临床用药提供理论基础。　　2.方法：　　(1)代谢活化致毒机制:DB对高表达和正常表达CYP3A4的HepG2和L02细胞毒性及代谢产物评价。首先表征HepG2和L02细胞中CYP3A4酶活。加入KT和不同浓度的DB，以MTT法评价DB对模型细胞毒性作用及KT对DB毒性的抑制作用。通过DB经CYP3A4代谢后产生的反应性中间体与外源性GSH的结合物M31做重点监测，进一步探讨DB的致毒机理及物质。　　(2)剂型筛选及脂质体处方优化研究:DB进行处方前研究包括:DB在不同溶剂中的溶解度，油水分配系数及pH的影响和热稳定性等。对DB最终剂型进行筛选，结果发现脂质体对DB的包封较好。以单因素考察法初筛各因素影响，分别考察不同二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和大豆卵磷脂(HSPC)中磷脂与胆固醇(CHOL)的摩尔比，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，泊洛沙姆407(F68)和投药量;对粒径及分布，Zeta电位和包封率(EE％)的影响。根据单因素考察结果，选取影响最主要参数为考察对象，采用星点设计-效应面法优化DB温度敏感型脂质体处方，并对其最优处方进行验证。　　(3) cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)的合成，表征及性能研究:以AIBN为引发剂，DMP为链转移剂，RAFT合成法p(NIPAAm-co-PAA)。cRGDyK-co-p(NIP AAm-co-PAA)的合成采用EDC/NHS技术，通过共价键连接形成酰胺键。共聚物成分组成通过H1NMR(氘化氯仿作为溶剂)的分析来确定，结合红外光谱(FTIR)鉴定结构。分子量使用凝胶渗透色谱(GPC)，此外还进行了共聚物的临界相变温度(LCST)和临界胶束浓度(CMC)测定。并对共聚物胶束的粒径及其分布和Zeta电位进行表征。　　(4) cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)修饰DB脂质体及表征:将cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)修饰DB脂质体。以强亲脂端DMP嵌入生物膜中。修饰后的脂质体通过粒径及其分布，Zeta电位等进行表征。以负染法制备靶向温敏脂质体样品，于透射电镜(TEM)下观察其形态。考察包封率(EE％)的变化。采用不同温度考察制备的脂质体最佳释药条件及对释药行为进行评价。　　(5)体外药效学评价:MTT法评价不同载体对肿瘤细胞的毒性。以香豆素-6(C-6)为标记物，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞试验分析比较不同载体对HepG2细胞摄取的作用。　　(6)体内研究:采用活体成像技术，以37℃和42℃条件下，分别考察包载DiR的不同剂型，在不同时间点荷瘤裸鼠体内分布情况，从而评价靶向温敏脂质体对肿瘤的靶向性。同时考察相同剂量的靶向温敏DB脂质体(C-P-LIP)和DB原药对肝毒性的影响。　　3.结果：　　(1)代谢活化致毒机制:CYP3A4酶活表征以睾酮为探针底物，检测生成6β-羟基睾酮的含量同时以9-氨基吖啶为内标物，以内标法计算响应值（产物峰面积/内标峰面积）。结果表明，高表达组HepG2和L02细胞酶活显著高于正常组。高表达组在各浓度下的细胞毒性显著高于正常组。加入KT后随着CYP3A4活性的降低，抑制了DB的代谢活化，DB细胞毒性也减弱。通过课题组前期建立的LC-MS/MS方法再一次确认了M31也存在于DB处理的HepG2与L02细胞中。结果表明，高表达组HepG2细胞和L02细胞中M31的含量在各个时间点均显著高于正常组中的含量。提示这种代谢中间体很可能就是DB导致细胞毒性的重要因素。　　(2) DB脂质体处方前和处方优化研究:建立DB的HPLC含量测定方法，DB在3.8-218μg/mL成线性。并且日内、日间精密度，加样回收率测定的RSD均小于3％。在DMF中溶解度最高，其次是乙腈。而在甲醇，乙酸乙酯，氯仿，丙二醇中，DB的溶解度均大于1 mg/mL。但在石油醚，水和丙酮中小于200μg/mL。DB的logP介于0.34-0.43之间，DB固体和水溶液在100℃条件下均能保持很好的稳定性。DB脂质体处方单因素考察结果为P∶C∶DSPE-PEG-2000=2∶1∶0.06，投药量为2 mg，以2％F68为水相。选取脂质体中3个指标如粒径、包封率及Zeta电位作为单个效应指标，利用总评归一值(OD)星点设计-效应面方法，确定最佳处方为P∶C=1.94∶1，投药量:1.57 mg，超声功率:29.08 mHz。所得粒径为170.3 nm，EE％=88％，Zeta电位为-40.3 mV，验证实验RSD＜0.6％，表明处方重复性好。　　(3) cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)的合成，表征及性能研究:RAFT法成功合成了p(NIPAAm-co-PAA)。H1NMR表明该聚合物同时具有NIPAAM，PAA，DMP的特征峰，同时链转移剂AIBN的δ=1.73的峰消失，δ=5.65及6.5处峰消失，说明PAA上C=C双键的消失。同时FTIR也表明，该聚合物同时就有上述三个化合物的特征峰。cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)的合成通过EDC/NHS活化法。H1NMR表明该聚合物p(NIPAAm-co-PAA)特征峰，δ=4.02(pNIPAAM次甲基重复链段上的H)，同时具有δ=1.69为cRGDyK特征峰。FTIR也显示在p(NIPAAm-co-PAA)的基础上同时具有明显的cRGDyK游离羧基宽峰。用乙醇注入法制备cRG DyK-co-p(NIPAAm-co-P AA)胶束所得粒径为130.1 nm，PDI为0.049。　　(4) cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)修饰脂质体的制备及表征:采用共孵育法制备共聚物修饰脂质体(C-P-LIP)，在聚合物为2.8％(w/w)时，其粒径最优，为139.5 nm，PDI=0.175，Zeta电位为-34.1 mV。且EE％稳定在85％以上。经TEM观察C-P-LIP成球状结构。体外释放试验表明修饰后的DB脂质体在4h内释放80％以上，较DB脂质体有显著的温敏释药性能。　　(5)体外药效学评价:空白C-P-LIP对HepG2细胞无毒性，表明生物相容性好。DB-C-P-LIP中DB终浓度在5-200μM，抗肿瘤作用随浓度升高而升高，且在高表达组抗肿瘤作用比正常组显著增强。DB-C-P-LIP抗肿瘤效果强于其他组。同时DB-C-P-LIP在42℃处理后抗肿瘤作用显著强于37℃。表明DB-C-P-LIP能显著增强DB的抗肿瘤作用是由于其温敏释药的特性和cRGDyK介导共同作用的结果。CLSM实验表明以包载C-6的C-P-LIP相对于其他剂型，能显著能加细胞摄取能力，且42℃组的细胞摄取能力显著强于37℃组。同时流式细胞试验与上述结果一致，即C-6-C-P-LIP细胞摄取量显著强于其他剂型，42℃组的细胞摄取量显著高于37℃组，以上结果表明C-P-LIP作为载体，能显著增强癌细胞的摄取能力。并且随着温度的升高，温度敏感特性使包载的物质快速释放。　　(6)体内评价:以DiR为荧光剂，制备DiR-LIP，DiR-P-LIP，DiR-C-P-LIP。采用小动物活体成像技术考察载体材料C-P-LIP体内靶向性。结果表明DiR-C-P-LIP相对于其他剂型能显著累积在肿瘤部位，并且42℃组较37℃组能显著增加体内靶向性。表明C-P-LIP能够靶向肿瘤部位，且温度在LCST时，释放内容物能力增强。DB和DB-C-P-LIP在相同剂量下，靶向温敏脂质体能显著降低ALT，AST水平，表明其能减轻DB引起的肝毒性。　　4.结论：　　(1) DB的细胞毒性作用是主要通过CYP3A4的代谢活化，生成的反应性活性中间体即顺式2-丁烯-1，4二醛衍生物可能为主要致毒物质，其致毒机制可能是该中间体与体内外的亲核物质或蛋白质不可逆结合。　　(2) DB水溶性和脂溶性较差，制成DB温敏脂质体能够很好改善水溶性。经单因素考察结合星点设计-效应面法对DB脂质体处方优化。且DB脂质体体外释放随着温度升高而增加。　　(3) cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-PAA)的合成通过RAFT法和NHS/EDC活化法。用乙醇注入法成功制备其胶束，该胶束LCST在42℃，具有温度敏感性且CMC较低，为3.38mg/L。　　(4) cRGDyK-co-p(NIPAAm-co-P AA)修饰在脂质体后，其粒径较小，分布较窄，稳定性高，成球状结构，包封率基本不变。该C-P-LIP在LCST时体外释药增强。　　(5) C-P-LIP载体能够显著增强对癌细胞的摄取能力，抗肿瘤作用明显增强，同时具有温度敏感性。在体内能显著靶向于肿瘤部位，且随着温度的升高，肿瘤部位的累积药量增加并能降低肝毒性。需进一步在体内药效学评价。