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芽变选种是柑橘重要的育种方式。叶是植物重要的营养器官,在遗传改良中占有举足轻重的地位,不同叶形状的变异可为优良新品系选择提供依据。研究柑橘叶片形态变异对解析叶发育机理、发掘重要的功能基因具有重要作用,还可为柑橘品种的遗传改良提供依据。本试验以古巴柳叶橙的窄叶野生型（N）和其宽叶突变体（W）为材料,利用形态学鉴定、显微切片技术对叶片形态变异组织结构进行鉴定,测定和比较了叶片发育相关的激素水平并利用转录组学和基因组重测序技术分别从生理和分子水平解析了古巴柳叶橙叶片变异的机理,主要结果如下:1、根据柑橘叶片发育的不同形态,将古巴柳叶橙野生型（N）及其突变体（W）叶片发育分为5个时期,分别是N1、N2、N3、N4、N5和W1、W2、W3、W4,W5。田间观察和形态学鉴定发现,叶片发育的各个时期,野生型和突变体叶片在叶宽、叶形指数、叶面积均有显著差异,进一步分析发现是叶片宽度的显著差异导致在叶形指数、叶面积上差异显著。通过嫁接繁殖后的叶片观察发现,宽叶型突变性状与嫁接前一致并且能稳定保持。2、对野生型N及其突变体W的叶片组织结构进行了石蜡切片、半薄切片和扫描电镜观察。石蜡切片观察发现N和W在叶发育的5个时期均有差异,主要表现在N的各个时期主叶脉的维管束组织占主脉比例较W的各个时期大。半薄切片观察发现,W5的叶片厚度比N5厚5.60%,差异显著;W5中构成栅栏组织的薄壁细胞排列疏松,而N5的栅栏组织排列更紧密;W5海绵组织细胞相对疏松,细胞间隙较多,而N5海绵组织细胞间隙相对较小。扫描电镜观察发现N5维管束结构、栅栏组织和海绵组织较W5紧密。3、采用HPLC-ESI-MS/MS法,测定了野生型和突变体叶片发育过程中的4种内源激素含量。结果显示,突变体中玉米素（ZT）的含量显著高于同时期的野生型且在二者中的变化趋势完全一致,即含量随着叶片的发育而降低;突变体中的脱落酸（ABA）含量也显著高于同时期的野生型,但变化趋势不同,在突变体中其含量随着叶片的发育而降低,而野生型中的变化趋势是先降低后升高;其含量在叶片发育中总体呈下降趋势;突变体中吲哚乙酸（IAA）含量比同时期的野生型低,但变化趋势不同,在突变体中其含量随着叶片的发育而降低,而野生型中的变化趋势是先降低后升高,在叶片发育过程中含量总体呈上升趋势;叶片发育过程中赤霉素3（GA3）含量较少,仅在W3与N3同时测出,表现为野生型高于突变体。4、将N1、N3、N5、W1、W3和W5时期叶片进行RNA-seq分析并以甜橙基因组（citrus.hzau.edu.cn）序列进行比对。结果显示,74.4%-78.7%的Clean Reads可以对比到基因组中,覆盖了全基因组的72.9-78.26%。6个样本总共组装拼接得到30921个基因。在野生型三个时期中,共有23728个表达基因,在突变体三个时期中,共有24089个表达基因。通过差异表达基因筛选发现,N1和W1时期的差异表达基因共有568个,N3和W3差异表达基因有207个,N5和W5差异表达基因有669个,其中在野生型和突变体叶片发育的所有时期均差异表达的基因有8个,分别是Cs1g16650、Cs1g26650、XLOC005927、Cs3g17390、Cs6g08500、Cs7g27120、orange1.1t03155和orange1.1t02879。WEGO分析发现三个时期的差异表达基因在细胞组分中主要参与cell、cell part、membrane、membrane part等细胞组成;在分子功能中基因主要参与binding、catalytic、transcription regulator等功能;在生物学过程中主要参与biological regulation、cellular process、metabolic process、pigmentation等过程。随机选取9个基因进行荧光定量PCR验证,结果发现测序结果的FPKM值与qRT-PCR表达量趋势大部分吻合,说明测序结果真实可信。将在W和N叶片发育各个时期均差异表达的8个差异表达基因在5个时期进行qRT-PCR分析,发现其中有5个基因表达具有差异,且在叶片极性发育的第一个时期差异最为显著。5、将野生型N及其突变体W进行基因组重测序,均获得14.56G以上的原始数据量。通过生物信息学分析并与甜橙基因组进行对比,（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/download/csi.chromosome.fa.tar.gz）,发现两者均发生单核苷酸多态性（SNP）、小片段的插入和缺失（InDel）、结构变异（SV）和拷贝数变异（CNV）,其中野生型N具有5390241个SNP,537847个InDel,23171个SV,6656个CNV;突变体W具有5410179个SNP,538048个InDel,24872个SV,6686个CNV。通过野生型和突变体样品间的比较,发现两者之间存在284495个SNP,5800个InDel,31552个SV和6679个CNV。对8个候选基因进行分析发现只有两个基因Cs7g27120和orange1.1t02879发生了SNP改变。本研究通过对古巴柳叶橙的野生型和宽叶突变体从性状的稳定性、形态特征、显微结构、激素水平和组学水平进行了初步的研究,初步发现宽叶突变性状能够稳定保持,在显微结构、激素水平等有显著差异,并发现了8个与性状相关的重要候选基因和在基因组水平上的差异,为进一步明晰叶片形态变异的机理奠定了坚实的基础。