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目的: 在海藻酸钠复合工程化软骨细胞对兔佐剂性关节炎的软骨缺损方面有一定疗效并显示一定抗炎作用的基础上,通过研究海藻酸钠支架、工程化软骨细胞及海藻酸钠支架复合工程化软骨细胞各对兔 AIA的抗炎作用及该组织工程学方法抗炎作用分子机制与Th17/Treg细胞平衡的关系,为临床上应用组织工程方法治疗RA提供理论依据并为RA的防治提供新的思路。 方法: ⑴40只实验用新西兰长耳白兔随机均分为5组(n=8):正常组,佐剂性关节炎模型组,海藻酸钠支架复合工程化软骨细胞治疗组,海藻酸钠支架治疗组,工程化软骨细胞治疗组。 ⑵抽取海藻酸钠支架复合工程化软骨细胞治疗组和工程化软骨细胞治疗组治疗组动物骨髓,用percoll密度梯度分离法提取出骨髓间充质干细胞,体外培养纯化至 P3代后加入诱导剂使其发育成为软骨细胞。 ⑶对模型组及治疗组兔膝关节腔注射完全弗氏佐剂诱导关节炎模型,正常组则注射等量生理盐水作为对照。 ⑷将制备好的海藻酸钠支架,等量的工程化软骨细胞悬液及海藻酸钠支架与工程化软骨细胞混合物三种治疗物回注到相对分组应兔子关节腔内,治疗一个月。正常组及模型组兔膝关节则注入等量生理盐水。 ⑸抽取5组兔子外周血进行ELISA检测Th17和Treg细胞相关细胞因子IL-22、IL-10和TGF-β的表达,RT-PCR检测关节滑膜Th17/Treg细胞相关转录因子RORγtmRNA和Foxp3mRNA表达水平的变化情况,并对关节滑膜进行组织病理学检测。 结果: ⑴注射完全弗氏佐剂21天后,正常组膝关节未见明显变化,造模实验兔的膝关节红肿,提示佐剂性关节炎模型制备成功。 ⑵自体骨髓经充质干细胞原代培养后形状呈梭形并在培养瓶中增殖后呈涡旋状分布,诱导培养后,梭形细胞向多角形或星形转变,阿利新蓝染成蓝色,标志工程化软骨细胞诱导成功。 ⑶关节滑膜病理学结果显示正常组滑膜未见炎症反应,模型组兔膝关节滑膜出现增生,炎细胞浸润明显,治疗组炎症反应有所减轻,组织工程治疗组抗炎作用最为明显。免疫组化结果显示正常组中 IL-17,IL-22的阳性表达较模型组低(P<0.05),细胞治疗组与支架治疗组与模型组比较无统计学差异,但有降低的趋势,组织工程治疗组下降明显(P<0.05);IL-10在正常组兔膝关节滑膜的表达中高于模型组(P<0.05),细胞治疗组与组织工程治疗组中的表达也较模型组高(P<0.05),支架治疗组与模型组比较无差异(P>0.05);与正常组比较,TGF-β1在模型组中表达较高(P<0.05),细胞治疗组和支架治疗组中 TGF-β阳性结果较模型组有所减少(P<0.05),组织工程治疗组与模型组比较则没有统计学差异(P>0.05)。 ⑷ELISA试剂盒检测兔外周血中TGF-β、IL-10、IL-22的表达水平。结果显示正常组中 TGF-β的表达量远高于模型组(P<0.01),组织工程治疗组较模型组升高明显(P<0.05),细胞治疗组及支架治疗组有所提升但无统计学差异(P>0.05);IL-10、IL-22在正常组及各治疗组中的表达水平较模型组比较无统计学意义(P>0.05)。 ⑸RT-PCR检测各组兔膝关节滑膜中Th17和Treg细胞关键转录因子Foxp3与RORγt的mRNA的表达。结果显示在正常组中 Foxp3 mRNA的相对表达量较模型组高(P<0.05),细胞治疗组及支架治疗组中 Foxp3 mRNA的相对表达量有升高的趋势(P>0.05),组织工程治疗组的相对表达量较模型组高(P<0.05),较正常组低。而滑膜中 RORγt mRNA的表达则相反,在模型组、细胞治疗组及支架治疗组中相对表达量较正常组和组织工程治疗组高。 结论: ⑴兔外周血中各组IL-10、IL-22的表达水平变化不太明显,TGF-β在正常组高表达,在模型组低表达,在各治疗组均有升高,但只有组织工程治疗组提升显著(P<0.05),提示海藻酸钠支架复合工程化软骨细胞治疗RA可能与TGF-β有关。 ⑵兔关节滑膜中RT-PCR检测Foxp3与RORγt的mRNA的相对表达量及免疫组化检测 TGF-β、IL-10、IL-22、IL-17的阳性表达结果均显示海藻酸钠支架复合工程化软骨细胞治疗 RA有一定抗炎效果,其可能是通过调节滑膜中 Th17细胞和 Treg细胞之间的平衡,进而调控其分泌的细胞因子,达到治疗RA的目的。